Eine konservierte MTMR-Lipidphosphatase unterdrückt im Alter zunehmend die Autophagie in Gehirnneuronen

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 21817 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Das Altern wird durch die fortschreitende, lebenslange Anhäufung von Zellschäden vorangetrieben. Autophagie (zelluläre Selbsternährung) fungiert als wichtiger Zellbeseitigungsmechanismus zum Abbau solcher Schäden, und ihre Kapazität nimmt mit zunehmendem Alter ab. Trotz ihrer physiologischen und medizinischen Bedeutung bleibt weitgehend unbekannt, warum die Autophagie im fortgeschrittenen Alter in vielen Zellen nicht mehr in der Lage ist, schädliches Zellmaterial wirksam zu eliminieren. Hier zeigen wir, dass altersbedingte Defekte beim autophagischen Abbau sowohl im frühen als auch im späten Stadium des Prozesses auftreten. Darüber hinaus reichert sich in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster die Myotubularin-verwandte (MTMR) Lipidphosphatase Ei-abgeleitete Tyrosinphosphatase (EDTP), die als Autophagie-Repressor bekannt ist, im Laufe des Erwachsenenlebens allmählich in Gehirnneuronen an. Der altersbedingte Anstieg der EDTP-Aktivität ist mit einer zunehmenden DNA-N6-Adenin-Methylierung am EDTP-Locus verbunden. MTMR14, das menschliche Gegenstück zu EDTP, neigt auch dazu, sich mit zunehmendem Alter in Gehirnneuronen anzureichern. Somit fördert EDTP und vermutlich MTMR14 die Alterung des Gehirns, indem es die Autophagie im Laufe des Erwachsenenalters zunehmend unterdrückt. Wir schlagen vor, dass EDTP- und MTMR14-Phosphatasen als endogene Alterungsfaktoren wirken, die die Alterungsrate von Neuronen weitgehend unabhängig von Umweltfaktoren bestimmen, und dass die Autophagie durch den DNA-N6-Methyladeninspiegel in Insekten beeinflusst wird.

Die Anhäufung von Zellschäden ist ein charakteristisches Merkmal praktisch aller alternden Zellen1,2,3,4,5,6,7. Zu diesen Schäden zählen vor allem oxidierte, aggregierte und fehlgefaltete (also nicht funktionale) Proteine, die zelluläre Prozesse und die Homöostase stören und dadurch zur Seneszenz und dem anschließenden Verlust der betroffenen Zellen führen. Ein massiver Zelltod kann dann zur Entwicklung verschiedener altersbedingter degenerativer Pathologien, insbesondere neurodegenerativer Erkrankungen, führen. Daher ist die wirksame Beseitigung beschädigter zytosolischer Materialien von entscheidender Bedeutung für den langfristigen Betrieb und das Überleben von Zellen, vor allem für diejenigen, die sich im Endstadium differenziert haben und ihre Fähigkeit zur Proliferation verloren haben, wie z. B. Neuronen.

Autophagie fungiert als wichtiger katabolischer Prozess eukaryontischer Zellen, durch den Zellschäden effektiv beseitigt werden können8,9,10,11,12. Bei der Autophagie werden Teile des Zytoplasmas an Lysosomen abgegeben, wo sie durch saure Hydrolasen abgebaut werden. Abhängig vom Mechanismus, durch den autophagische Fracht in das lysosomale Kompartiment transportiert wird, können drei Haupttypen der Autophagie unterschieden werden: Mikroautophagie, Chaperon-vermittelte Autophagie und Makroautophagie. Bei der Makroautophagie (im Folgenden als Autophagie bezeichnet) handelt es sich um die Bildung eines doppelmembrangebundenen Vesikels namens Autophagosom, um die für den Abbau bestimmten Zytoplasmamaterialien zu binden. Das Autophagosom verschmilzt dann mit einem Lysosom und bildet ein Autolysosom, in dem schließlich der enzymatische Abbau stattfindet (Abb. 1, A). Defekte im autophagischen Prozess sind mit der Entwicklung verschiedener neurodegenerativer Pathologien verbunden9,13,14. Dies erhöht die Möglichkeit, dass die Autophagie in Neuronen im fortgeschrittenen Alter weniger effektiv funktioniert als im frühen Erwachsenenstadium. Beim Nematoden Caenorhabditis elegans und der Fruchtfliege Drosophila melanogaster wurde tatsächlich festgestellt, dass die Autophagie bei älteren Tieren deutlich geringer ausfällt als bei jungen Erwachsenen15,16,17. Dieser altersbedingte Rückgang der autophagischen Kapazität geht mit einer verminderten Expression eines Schlüsselgens im Zusammenhang mit der Autophagie (Atg) einher, Atg8/LC3B (Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​1A/1B leichte Kette 3B), das für ein Ubiquitin-ähnliches Protein kodiert, das für erforderlich ist die Bildung autophagischer Membranstrukturen18. Trotz ihrer physiologischen und medizinischen Bedeutung ist noch weitgehend unbekannt, warum die Fähigkeit der Autophagie in Neuronen mit zunehmendem Alter abnimmt. Stochastische Prozesse, einschließlich zufälliger inaktivierender Mutationen in Atg-Genen im Genom einzelner Neuronen, sollten sicherlich zum Zerfall beitragen6,7. Möglicherweise spielen auch noch weitgehend unerforschte regulatorische Faktoren eine Rolle. Laut einer aktuellen Studie hemmt Rubicon (RUN-Domäne und Cystein-reiche Domäne enthaltend, Beclin 1-interagierendes Protein), das die Autophagie durch Interaktion mit einem Proteinkomplex, der Beclin 1 (Coiled-Coil, Myosin-ähnliches BCL2-interagierendes Protein) enthält, hemmt. Vps15/p150 (Vacuolar protein sorting 15), PI3K (die Phosphatidylinositol-3-Kinase der Klasse III) und UVRAG (Ultraviolet Radiation Resistance-associated gene) regulieren den Prozess während des Alterns bei Würmern, Fliegen und Mäusen zunehmend herunter19. Warum sich Rubikon mit zunehmendem Alter in verschiedenen Zelltypen ansammelt, bleibt jedoch ungeklärt.

Die Fähigkeit zur Autophagie nimmt im Gehirn von Drosophila mit zunehmendem Alter allmählich ab. (A) Der makroautophagische Prozess bei Säugetieren. Während der Autophagie werden unerwünschte zytoplasmatische Bestandteile (Proteine ​​und Mitochondrien sind angegeben) in einem doppelmembrangebundenen Vesikel namens Autophagosom sequestriert. Autophagosom entsteht durch die Verlängerung und Verschmelzung einer Phagophormembran. Das Schema zeigt, wo die autophagischen Marker Atg5, Klasse III PI3K, Atg8/LC3B-II und SQSTM1/p62 ihre Wirkung während des Prozesses ausüben. Atg5 und PI3K (letzteres wird durch 2xFYVE-GFP angezeigt) markieren frühe Phasen des Prozesses (Phagophorbildung), Atg8/LC3B-II bezeichnet sowohl Phagophore als auch Autophagosomen, während p62 ein Adapterprotein ist, das als Substrat für den autophagischen Abbau dient. Atg8-I: lösliche Form; Atg8-II: membrankonjugierte Form. Die Cysteinprotease Atg4 dekonjugiert Atg8-II von der autophagosomalen Membran (dh sie vermittelt die Umwandlung von Atg8-II in Atg8-I), wenn Autophagosom gebildet wird. MTMR14 hemmt die Bildung der autophagischen Membran, indem es den Klasse-III-PI3K-Komplex antagonisiert. Balken zeigen negative regulatorische Wechselwirkungen an, Pfeile zeigen Aktivierungen an. (B) Spiegel von Atg5- (erste Reihe), 2xFYVE-GFP- (zweite Reihe), eGFP-Atg8a (dritte Reihe) und Ref(2)P/p62-positiven Strukturen (vierte Reihe) im Gehirn von Drosophila-Erwachsenen bei verschiedene Alter. Atg5 und 2xFYVE-GFP markieren frühe autophagische Strukturen, Phagophore und entstehende Autophagosomen. In jeder Reihe wurden fluoreszenzmikroskopische Bilder mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Für 2xFYVE-GFP wurde ein GFP-markiertes Transgen verwendet, ansonsten wurden spezifische Antikörper verwendet. Maßstabsbalken entsprechen 25 µm. Die Hoechst-Färbung (blau) weist auf Kerne hin. (B′–B″″) Quantifizierung von Atg5-, 2xFYVE-GFP-, eGFP-Atg8a- und Ref(2)P-positiven Strukturen. (C) Western-Blot-Analyse, die die relativen Ref(2)P- und Atg8a-I/II-Spiegel in Ganzkopfextrakten zeigt, die in verschiedenen Erwachsenenstadien präpariert wurden. Atg8a-II markiert Phagophore und Autophagosomen. Als interne Kontrolle wurde α-Tub84B verwendet. (C,C'') Quantifizierung der relativen Ref(2)P-Dichten sowie der relativen Atg8-I- und Atg8-II-Spiegel, bestimmt durch die Western-Blot-Analyse (C). In den Feldern (B′–B″″), (C′) und (C″) stellen die Kästchen im Diagramm die typischsten 50 % der Proben dar, die Linie zeigt den Median an, die oberen und unteren Whisker zeigen die verbleibenden 25– 25 % der Proben. Kreise markieren Ausreißer. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001 bei jedem Vergleich mit Tag 1. Statistiken finden Sie unter „Materialien und Methoden“.

Die Bildung früher autophagischer Membranstrukturen erfordert bestimmte Phosphoinositid (PI)-Derivate wie Phosphatidylinositol-3-phosphat (PI3P), das durch das Klasse-III-PI3K-Enzym aus PI umgewandelt wird (Abb. 1A)20. PI3K, auch Vps34 (Vakuolenproteinsortierung) genannt, ist ein Mitglied des autophagischen Vesikelkeimbildungskomplexes. Unter normalen Bedingungen antagonisieren die Myotubularin-verwandte Lipidphosphatase MTMR14 von Säugetieren und ihr Drosophila-Orthologe EDTP (Egg-derived Tyrosin Phosphatase) PI3K/Vps34, um die schädliche Hyperaktivierung der Autophagie zu verhindern21,22,23. MTMR14 hemmt die basale Autophagie durch die Umwandlung von PI3P in PI24. Bei genetischen Hintergründen mit Defekten für MTMR14 oder EDTP ist die Menge an PI3P-angereicherten Strukturen im Vergleich zur Kontrolle erhöht22,25. Neben diesem Anfangsstadium der Autophagie reguliert MTMR14 auch ein späteres Stadium des Prozesses, die Fusion des Autophagosoms mit einem Lysosom (Abb. 1A)22. In dieser Studie zeigen wir, dass sich EDTP und MTMR14 mit zunehmendem Alter zunehmend in Gehirnneuronen anreichern. Diese konservierten MTMR-Lipidphosphatasen tragen zum altersabhängigen Rückgang der Autophagie in Neuronen bei und fördern so die Alterung des Gehirns.

Um besser zu verstehen, wie die Autophagie mit zunehmendem Alter abnimmt, haben wir zunächst die relativen Werte der autophagischen Aktivität während der Erwachsenenlebensspanne bei Drosophila bestimmt. Zwei weit verbreitete Marker zur Überwachung früher Stadien der Autophagie, Atg5 und die 2xFYVE-Domäne (Abb. 1A)26,27, zeigten allmählich abnehmende Akkumulationsniveaus in Gehirnen, die aus erwachsenen Fliegen in verschiedenen Lebensstadien isoliert wurden (Abb. 1B–B″). Da Atg5 eine Rolle bei der Erweiterung der wachsenden Isolationsmembran namens Phagophor spielt, korreliert sein Spiegel mit der Menge der Struktur28. Die FYVE-Domäne bindet PI3P, daher ist ihre Menge proportional zur PI3K/Vps34-Aktivität29. Die Anwendung dieser Marker zeigte deutlich, dass die Bildung von Phagophoren in Gehirnneuronen mit zunehmendem Alter des Organismus allmählich abnimmt. Wir haben auch die Menge der autophagischen membrankonjugierten Form von Atg8a, Atg8a-II30, untersucht. Die Menge an Atg8a-positiven autophagischen Strukturen, die durch einen endogen exprimierten eGFP-Atg8a-Reporter31 markiert wurden, stieg im Gehirn während der Lebensspanne eines Erwachsenen zunehmend an (Abb. 1B–B ‴). Da eGFP empfindlich auf einen niedrigen pH-Wert reagiert, ist es in sauren Kompartimenten inaktiv und markiert dadurch Phagophore und Autophagosomen, nicht jedoch Autolysosomen. Ähnliche Ergebnisse wurden beim Testen der Atg8a-II-Spiegel in Gehirnextrakten von erwachsenen Tieren in verschiedenen Stadien mithilfe einer Western-Blot-Analyse erhalten (Abb. 1C, C″). Im Gegensatz zu Atg8a-II blieb der Spiegel der nicht-konjugierten, löslichen Form von Atg8a (Atg8a-I) im gesamten Erwachsenenalter nahezu konstant. Diese Daten deuten darauf hin, dass trotz geringerer Phagophorbildung Autophagosomen im Laufe des Erwachsenenlebens mit zunehmender Geschwindigkeit erzeugt wurden. Alternativ war auch ein späteres Stadium des Abbauprozesses betroffen, was zu einer Nettoakkumulation von Autophagosomen oder nicht verdauungsfähigen Autolysosomen führte. Möglicherweise ist die Autophagosom-Lysosom-Fusion, die lysosomale Ansäuerung oder der Abbau des autolysosomalen Inhalts das betroffene Stadium.

Um zwischen den beiden oben genannten Alternativen zu unterscheiden, haben wir die Menge an Ref(2)P, dem Fliegen-Gegenstück zu menschlichem p62/SQSTM1 (Sequestosom 1), während der Lebensspanne eines Erwachsenen bestimmt15. Da p62/SQSTM1 als Substrat für den autophagischen Abbau dient (das Protein verbindet die Ladung mit membrangebundenem Atg8/LC3B), ist sein Spiegel umgekehrt proportional zur autophagischen Aktivität32,33. Unter Verwendung eines Ref(2)P-spezifischen Antikörpers führten wir eine immunhistochemische Analyse an Gehirnproben durch, die in verschiedenen Erwachsenenstadien präpariert wurden, und stellten fest, dass die Menge an unlöslichen Proteinaggregaten, die durch den Antikörper markiert wurden, umso höher war, je älter das Tier war (Abb. 1B, B""). Um diese Ergebnisse zu untermauern, wurde eine anschließende Western-Blot-Analyse auf Ganzkopfproben angewendet, wobei derselbe Ref(2)P-spezifische Antikörper verwendet wurde. In Übereinstimmung mit den durch Fluoreszenzmikroskopie erhaltenen Daten stieg die Menge an löslichem Ref(2)P-Protein mit zunehmendem Alter in Kopfextrakten allmählich an (Abb. 1C, C′). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass der autophagische Abbau im Laufe des Alterns in zwei Phasen des Prozesses beeinträchtigt wird. Erstens, wie sich an den verringerten Atg5- und PI3P-Spiegeln zeigt, bei der Vesikelkeimbildung, wenn sich der Phagophor bildet und wächst. Zweitens, was durch eine erhöhte Atg8a-II-Akkumulation angezeigt wird, nach der Autophagosomenbildung, wenn die Struktur mit einem Lysosom verschmilzt oder der autolysosomale Inhalt enzymatisch verdaut wird. Wir kommen zu dem Schluss, dass die Autophagie in Gehirnneuronen mit zunehmendem Alter aufgrund der kumulativen Wirkung einer unterdrückten Autophagosomenbildung und einer beeinträchtigten autolysosomalen Funktion allmählich abnimmt.

Es wurde gezeigt, dass MTMR14 die Autophagie sowohl im frühen (Phagophorbildung) als auch im späten Stadium (Autolysosomenbildung) des Prozesses beeinflusst (Abb. 1A, 2A)22. Darüber hinaus haben wir zuvor gezeigt, dass EDTP die basale Autophagie im Fettkörper von Drosophila wirksam hemmt23,25,34 und dass sich MTMR14 in der menschlichen Hirnrinde reichlich anreichert35. Hier haben wir gezeigt, dass die Atg8a-II- und Ref(2)P-Spiegel in einem EDTP-überexprimierenden genetischen Hintergrund ansteigen (Abb. 2B–B‴), in einem EDTP-hypomorphen Mutantenhintergrund jedoch niedriger sind (Abb. 2C–C‴). Darüber hinaus erhöhte die Überexpression von EDTP die Menge an ubiquitinierten Strukturen signifikant (Abb. S1A-A′). Dies legt nahe, dass EDTP unter normalen Bedingungen neben der Autophagosomenbildung nach der Atg8a-Lipidierung auch die Autophagie hemmt.

EDTP-Hyperaktivität hemmt die autophagische Aktivität im Drosophila-Gehirn, während EDTP-Mangel die autophagische Aktivität verstärkt. (A) Enzymatische Funktion von Drosophila EDTP und MTMR14-Lipidphosphatasen von Säugetieren. Die beiden Proteine ​​wandeln PI3P in PI um und hemmen dadurch die Bildung der autophagischen Membran. (B) Die Western-Blot-Analyse zeigt im Vergleich zur Kontrolle erhöhte EDTP- und Ref(2)P-Spiegel in einem genetischen Hintergrund, der EDTP überexprimiert. Auch die autophagische membrankonjugierte Form von Atg8a (Atg8a-II) nimmt im Vergleich zu Atg8a-I zu, das die lösliche (nicht konjugierte) Form von Atg8a darstellt. (B′–B‴) Quantifizierung der relativen EDTP-, Ref(2)P-, Atg8a-I- und Atg8a-II-Spiegel, bestimmt durch die Western-Blot-Analyse (B). (C) Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass die relativen Werte von EDTP, Ref(2)P und Atg8a-II/Atg8a-I-Verhältnis jeweils im genetischen Hintergrund mit EDTP-Defekt (hypomorpher Mutant) im Vergleich zur Kontrolle abnehmen. (C′–C‴) Quantifizierung der relativen EDTP-, Ref(2)P-, Atg8a-I- und Atg8a-II-Dichten, identifiziert durch die Western-Blot-Analyse (C). In den Panels B und C wurden Proteine ​​aus dem Kopf weiblicher Fruchtfliegen extrahiert, αTub84B wurde als interne Kontrolle verwendet und die Tiere wurden bei 29 °C gehalten. Im Diagramm stellen die Kästchen die typischsten 50 % der Proben dar, die Linie zeigt den Median, die oberen und unteren Whisker zeigen die verbleibenden 25–25 % der Proben. Kreise markieren Ausreißer. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. Statistiken finden Sie unter „Materialien und Methoden“.

Um die neuronale Rolle von EDTP bei der Autophagiekontrolle besser zu verstehen, haben wir die Co-Lokalisierung der Reporter mCherry-Atg8a und GFP-Lamp1 (lysosomale Struktur-spezifisch) bei 7 und 21 Tage alten Erwachsenen überwacht, die bei 29 °C gehalten wurden (Abb . 3A,A′ und Abb. S1B–B‴). Die EDTP-Stummschaltung (EDTP-RNAiV22) und die Überexpression (EDTPGSV6) erhöhten jeweils die Co-Lokalisierung dieser Marker bei älteren Tieren im Vergleich zur gleichaltrigen Kontrollgruppe. In Kontrollgenotypen war die Menge der durch beide Marker markierten Strukturen bei älteren Erwachsenen signifikant höher als bei jungen Erwachsenen (Abb. 3A″–A‴ und Abb. S1B′). Die EDTP-Herunterregulierung erhöhte die Anzahl der mCherry-Atg8a- und GFP-Lamp1-spezifischen Strukturen, während die EDTP-Hyperaktivität sank (Abb. 3A“, „A“ und Abb. S1B′). Die lipidierte Form von Atg8a (Atg8a-II) ist ein Substrat des autophagischen Abbaus, und der mCherry-Reporter toleriert das saure Milieu von Autolysosomen . Dies kann erklären, warum ein EDTP-Mangel die Menge an Autolysosomen (mCherry-Atg8a-positive Strukturen) in einem fluoreszierenden mikroskopischen Test erhöht, aber die Atg8a-II-Spiegel in einer Western-Blot-Analyse verringert (Abb. 3A, A″ und Abb. 2C, C‴). . Daher könnte eine Überexpression von EDTP die Autophagie hemmen, indem sie weniger autophagische Strukturen erzeugt. Obwohl diese Strukturen in der Lage sind, mit Lysosomen zu fusionieren, scheint der Abbauprozess beeinträchtigt zu sein (was durch die Akkumulation von Atg8a-II-Spiegeln und eine erhöhte mCherry-Atg8a-GFP-Lamp1-Co-Lokalisierung angezeigt wird) (Abb. 2, 3). Es ist bekannt, dass MTMR-Proteine ​​an der Autophagie beteiligte Lipide dephosphorylieren, wie z. B. PI(3,5)P238, das für nachgelagerte Stufen des autophagischen Prozesses erforderlich ist, einschließlich der Ansäuerung von Lysosomen39 und der lysosomalen Biogenese40. Unseren Ergebnissen zufolge kann EDTP gleichzeitig die Vesikelkeimbildung (über den antagonisierenden Vsp34-Komplex) und den lysosomalen Abbau in Neuronen blockieren.

EDTP hemmt sowohl die Keimbildung autophagischer Vesikel als auch den sauren Abbau im Drosophila-Gehirn. (A) Fluoreszenzbilder, die die Co-Lokalisierung der Reporter GFP-Lamp1 (grün) und 3xmCherry-Atg8a (rot) in Neuronen des erwachsenen Drosophila-Gehirns zeigen. Gelbe Pfeile zeigen Strukturen an, die mit beiden Markierungen markiert sind. Weiße Quadrate markieren die vergrößerten Bereiche. In den Diagrammen sind statistische Daten von Proben von Tieren im Erwachsenenstadium von 7 und 21 Tagen dargestellt (A′–A‴). Die Tiere wurden bei 29 °C gehalten. Im Diagramm stellen die Kästchen die typischsten 50 % der Proben dar, die Linie zeigt den Median, die oberen und unteren Whisker zeigen die verbleibenden 25–25 % der Proben. Kreise markieren Ausreißer. P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001. Statistiken finden Sie unter „Materialien und Methoden“.

Relevante Literaturdaten und die oben genannten Ergebnisse veranlassten uns, die mit dem Erwachsenenstadium verbundenen relativen Werte (dh die Akkumulationsdynamik) dieser konservierten MTMR-Lipidphosphatasen in Gehirnneuronen während der gesamten Lebensspanne eines Erwachsenen zu untersuchen. Zu diesem Zweck haben wir die EDTP-Akkumulation im Gehirn während der gesamten Lebensspanne eines Erwachsenen untersucht. Die EDTP-Expression wurde zunächst durch ein fluoreszierendes Genfallensystem überwacht, bei dem ein trojanischer EDTP-Gal4-Treiber in die erste intronische Sequenz des EDTP-Gens eingefügt wird, der die UAS-myr-GFP-Reporteraktivität steuert (Abb. S2A). Die EDTP-Aktivität zeigte einen allmählichen, altersbedingten Anstieg des Organs (Abb. 4A, A′). Zwischen jungen (Tag 10) und älteren (Tag 60) Erwachsenen wurde ein nahezu dreifacher Unterschied festgestellt. Diese altersbedingte Verschiebung der EDTP-Transkription zeigte sich besonders deutlich in Gehirnstrukturen, die als Pilzkörper, subösophageale Ganglien und Antennenlappen bezeichnet werden (Abb. 3A und Abb. S1B) und ging nicht mit einem Anstieg der Anzahl von Neuronen einher, die EDTP akkumulieren (Abb. S2C,C′). Während des Alterns veränderten sich die Werte der autophagischen Marker im Bereich des Pilzkörpers deutlich; Die Menge der durch 2xFYVE-GFP markierten Strukturen wurde verringert, während die Ref(2)P-Werte zunahmen (Abb. S2D–E′). Eine quantitative PCR-Analyse an Kopfproben zeigte auch höhere Mengen an EDTP-Transkripten bei alten Tieren im Vergleich zu jungen Tieren (Abb. 4B). Diese Ergebnisse zeigen, dass die EDTP-Transkriptwerte in Gehirnneuronen mit zunehmendem Alter des Tieres allmählich ansteigen, was im Einklang mit einer früheren genomweiten Genexpressionsanalyse steht, bei der genetische Faktoren identifiziert wurden, die während des Alterns von Drosophila hoch- oder herunterreguliert werden41.

EDTP wird während der Lebensspanne von Drosophila-Erwachsenen zunehmend in Gehirnstrukturen exprimiert. (A) Fluoreszenzmikroskopische Bilder, die die Expression eines EDTP-Trojaner-Gen-Fallensystems (Transkriptionsaktivität von EDTP) im Gehirn zeigen, seziert in verschiedenen Stadien des Erwachsenenalters (Tage sind angegeben). Die Bilder wurden mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Die Hoechst-Färbung (blau) weist auf Kerne hin. Rote Sternchen kennzeichnen die Medulla (stark leuchtend), die von der Analyse ausgeschlossen wurden. Maßstabsbalken entspricht 100 µm. Eine weiße gepunktete Linie umreißt den Gehirnabschnitt, in dem die Analyse durchgeführt wurde. (A′) Quantifizierung der relativen EDTP-Expressionsniveaus im Gehirn erwachsener Fliegen in verschiedenen Altersstufen. (B) Die qPCR-Analyse von Gehirnextrakten zeigt, dass die EDTP-Transkriptspiegel bei älteren Erwachsenen (Tag 50 und Tag 60) höher sind als bei jungen Erwachsenen (Tag 10). (C) Die Western-Blot-Analyse zeigt, dass sich EDTP mit zunehmendem Alter in Drosophila-Kopfextrakten ansammelt. αTub84B wurde als interne Kontrolle verwendet. (C′) Quantifizierung der relativen EDTP-Spiegel in Kopfextrakten in verschiedenen Erwachsenenstadien, bestimmt durch die Western-Blot-Analyse (C). Die Tiere wurden bei 25 °C gehalten. In den Feldern (A′)), (B) und (C′) stellen die Kästchen die typischsten 50 % der Proben dar, die Linie zeigt den Median, die oberen und unteren Whisker zeigen die verbleibenden 25 %–25 % der Proben . Kreise markieren Ausreißer. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 bei jedem Vergleich mit Tag 1. Statistiken finden Sie unter „Materialien und Methoden“ und Tabelle S1. (D) Die N6-Adenin-Methylierung am EDTP-Locus nimmt bei Drosophila mit zunehmendem Alter allmählich zu. Relative N6-Methyladenin-Spiegel (6 mA) am EDTP-Locus in verschiedenen Erwachsenenstadien. (D′) Quantifizierung der relativen 6-mA-Werte am EDTP-Standort. Die Tiere wurden bei 29 °C gehalten. In den Panels (D′) war *P < 0,05, **P < 0,01 bei jedem Vergleich mit Tag 7.

Mit einem EDTP-spezifischen Antikörper testeten wir als nächstes die Menge des Proteins in Ganzkopfextrakten. Der Antikörper war in der Lage, EDTP im Wildtyp zu markieren, konnte jedoch weitgehend keine EDTP-positive Bande im EDTPMI08496-Mutantenhintergrund markieren (Abb. 2C–C‴). Eine durchgeführte Western-Blot-Analyse ergab, dass sich EDTP im Laufe des Erwachsenenlebens zunehmend im Kopf ansammelt (Abb. 4C–C′). Daher nimmt die EDTP-Aktivität im Gehirn von Drosophila mit zunehmendem Alter zunehmend zu.

Um zu verstehen, warum die EDTP-Expression mit zunehmendem Alter in Gehirnneuronen zunimmt, untersuchten wir Veränderungen in der N6-Methyladenin-DNA-Modifikation (6 mA) am EDTP-Locus im Erwachsenenalter (im Allgemeinen fördert die Methylierung von Adenin an der N6-Position die Transkription am betroffenen Locus). Relative 6-mA-Werte an jeder genomischen Stelle, die eine GATC-Sequenz enthält, können durch eine PCR-basierte Methode bestimmt werden, die einen methylierungsempfindlichen enzymatischen DpnI-Verdau der genomischen DNA und eine PCR-Amplifikation der Zielstelle umfasst (Abb. 4D)42. Wir fanden heraus, dass die relativen 6-mA-Werte an der Zielstelle im Laufe der Lebensspanne des Erwachsenen tendenziell ansteigen; ein Abfall der 6-mA-Werte war erst im letzten Erwachsenenstadium zu beobachten (Abb. 4D–D′). Daher können altersbedingte Veränderungen der EDTP-Expression und infolgedessen Veränderungen der autophagischen Aktivität in diesem Organismus epigenetisch bedingt sein. Interessanterweise war eine ähnliche Veränderung im Fall des menschlichen MTMR14-Gens nicht nachweisbar (Daten nicht gezeigt).

Bewegungsstörungen sind ein charakteristisches Merkmal gealterter Fliegen2,3,30,39,41. Da die Fortbewegung durch Neuronen koordiniert wird, untersuchten wir die Kletterfähigkeit bei kontrollierten Tieren im Vergleich zu EDTP-defekten (d. h. Autophagie-überaktiven) Tieren in verschiedenen Erwachsenenstadien. Die Herunterregulierung von EDTP wurde speziell in dopaminergen Neuronen durch die Verwendung eines ple-Gal4-Treibers und zwei unabhängiger, effektiv funktionierender RNAi-Konstrukte, EDTP-RNAi(V22) und EDTP-RNAi(dsRNA) erreicht (siehe „Materialien und Methoden“ und Abb. S3A). –D′, S4A–A′). Beide Behandlungen steigerten die Fähigkeit der Tiere, innerhalb eines bestimmten Zeitraums an der Wand eines Glasfläschchens hochzuklettern, deutlich (Abb. 5A, A′ und Abb. S3A′). Im Fall des EDTP-RNAi(dsRNA)-Konstrukts war eine Verbesserung der Bewegung auch im späteren Erwachsenenstadium erkennbar (Tag 21 und 28, Abb. 5A,A′). Aus diesen Ergebnissen schließen wir, dass ein altersbedingter Rückgang der autophagischen Aktivität in bestimmten Neuronen zu einer Beeinträchtigung der Fortbewegung älterer Personen beiträgt und dieser Effekt durch EDTP-Mangel in den betroffenen Neuronen erheblich verzögert oder abgeschwächt werden kann. Es ist erwähnenswert, dass in einem Kontrollexperiment die EDTP-Herunterregulierung deutlich zunahm, während die EDTP-Hyperaktivität die Anzahl der 2xFYVE-GFP-positiven frühen autophagischen Strukturen in den betroffenen Zellen sowohl im jungen als auch im alten Erwachsenenstadium senkte (Abb. S5).

Eine Herunterregulierung von EDTP in Neuronen kann die Kletterfähigkeit verbessern, die Protein-Ubiquitinierung im Gehirn verringern und die Lebensdauer verlängern. (A–A′) Unter Verwendung zweier verschiedener RNAi-Konstrukte (siehe auch Abb. S2B, B′) wurde EDTP in dopaminergen Neuronen herunterreguliert. Die Fliegen wurden bei 29 °C gehalten, eGFP-RNAi (zeigt ON-zielfreie UAS-Transgenkontrolle an) und EDTP-RNAi wurden von einem ple-Gal4-Treiber angetrieben, der nur in dopaminergen Neuronen exprimiert wurde. (B) Fluoreszenzbilder, die die Ansammlung ubiquitinierter Proteine ​​(grüne Aggregate) im Gehirn erwachsener Fliegen in verschiedenen Stadien (7 und 21 Tage) zeigen. Als Kontrolle wurde eGFP-RNAi verwendet. Die Hoechst-Färbung (blau) weist auf Kerne hin. Die Tiere wurden bei 29 °C gehalten. Der Maßstabsbalken stellt 40 µm dar. RNAi-Konstrukte wurden von Appl-Gal4 gesteuert. (B′) Quantifizierung ubiquitinierter Proteine ​​in zwei verschiedenen Erwachsenenstadien. (C) Kaplan-Meyer-Lebensdauerkurven von eGFP-RNAi (ON-target free RNAi control) versus EDTP-RNAi(dsRNA) (EDTP wurde speziell in dopaminergen Neuronen herunterreguliert) Fliegen. Die Tiere wurden bei 25 °C gehalten. (C′) Daten zur durchschnittlichen Lebensspanne der auf Tafel (C) gezeigten Tiere. (D) Kaplan-Meyer-Lebensdauerkurven von eGFP-RNAi (ON-target free RNAi control) im Vergleich zu EDTP-RNAi(V22) und EDTP-RNAi(dsRNA) (EDTP wurde nur in dopaminergen Neuronen herunterreguliert) Tieren. Die Fliegen wurden bei 29 °C gehalten. (D′) Daten zur durchschnittlichen Lebensspanne der in Tafel (D) gezeigten Tiere. In den Feldern (A), (A′), (B′), (C′) und (D′) stellen die Kästchen die typischsten 50 % der Proben dar, die Linie zeigt den Median an, die oberen und unteren Whisker zeigen die verbleibenden 25–25 % der Proben. Kreise markieren Ausreißer. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, die statistische Analyse wurde wie in den Materialien und Methoden beschrieben durchgeführt, Statistiken siehe Tabelle S1.

Bei älteren Menschen werden zytoplasmatische Proteine ​​häufig ubiquitiniert, und diese molekulare Markierung unterstützt den proteasomalen oder autophagischen Abbau der markierten Faktoren. Wir haben die altersbedingte Akkumulation ubiquitinierter Proteine ​​in normalen Gehirnproben im Vergleich zu EDTP-defekten Gehirnproben getestet, indem wir einen panneuronalen Appl-Gal4-Treiber verwendet haben, der im Wesentlichen in allen Neuronen aktiv ist. In Kontrollproben stiegen die Mengen an Ubiquitin-markierten Strukturen mit zunehmendem Alter signifikant an, und diese Veränderung wurde durch die Herunterregulierung von EDTP wirksam unterdrückt (Abb. 5B, B′). Eine Herunterregulierung von EDTP erhöhte die Menge an mCherry-Atg8a- und GFP-Lamp1-positiven Strukturen (Abb. S3C–D′) und verringerte im Vergleich dazu die Ref(2)P-Spiegel bei 21 Tage alten Tieren, die bei 29 °C gehalten wurden, signifikant mit Steuerung (Abb. S4C–D′). Somit schützt die Steigerung der autophagischen Aktivität durch Hemmung der EDTP-Funktion Neuronen vor der Ansammlung beschädigter Proteine, was ein allgemeines Merkmal verschiedener neurodegenerativer Pathologien ist.

Da die Autophagie eine zentrale Rolle bei der Regulierung des Alterungsprozesses spielt2,3,4,43 und das Altern durch Signalsysteme gesteuert wird, die in bestimmten Neuronen wirken16, haben wir auch die Auswirkung der dopaminergen neuronenspezifischen EDTP-Herunterregulierung auf die Lebensdauer getestet. EDTP wurde im Erwachsenenalter mithilfe des ple-Gal4-Treibers und zweier unabhängiger RNAi-Konstrukte gezielt herunterreguliert (Abb. S3A–B′; Tiere wurden kontinuierlich bei 25 oder 29 °C gehalten). Wir beobachteten, dass auf EDTP herunterregulierte Tiere bei beiden getesteten Temperaturen länger lebten als die Kontrolltiere (Abb. 5C–D′ und Tabelle S1). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine Erhöhung der autophagischen Aktivität in dopaminergen Neuronen durch EDTP-Mangel zu einem Langlebigkeitseffekt führen kann. Im Gegensatz dazu begrenzt die Überexpression von EDTP die Lebensdauer und beeinträchtigt die Kletterfähigkeit (Abb. S6A, A′).

Um die Frage zu klären, ob die regulatorische Rolle dieser Familie von MTMR-Lipidphosphatasen bei der Gehirnalterung evolutionär erhalten bleibt, haben wir als nächstes altersabhängige Veränderungen der autophagischen Aktivität und die MTMR14-Akkumulation in menschlichen Gehirnneuronen beobachtet. Die p62/SQSTM1-Spiegel wurden erstmals in postmortalen menschlichen Gehirnproben bestimmt, die in verschiedenen (mittleren und hohen) Erwachsenenaltern isoliert wurden. Wir fanden heraus, dass sich das Protein bei älteren Personen (70–80 Jahre) häufiger in Gehirnneuronen anreichert als bei jüngeren Personen (40–55 Jahre) (Abb. 6A, A′ und Tabelle S2). Daher kann es auch während der Gehirnalterung beim Menschen zu einem allmählichen Rückgang der Autophagiekapazität kommen. Angesichts dieser negativen Veränderung der autophagischen Aktivität lässt sich erklären, warum nicht-proliferierende Neuronen dazu neigen, nach und nach Zellschäden anzuhäufen und im Laufe der Zeit zunehmend anfällig für den Untergang zu werden, was im fortgeschrittenen Alter zur Entwicklung verschiedener neurodegenerativer Erkrankungen führt.

Menschliches SQSTM1/p62 und MTMR14 reichern sich mit zunehmendem Alter in Gehirnneuronen an. (A) Fluoreszenzbilder, die die SQSTM1-Akkumulation (grün) in postmortalen menschlichen Gehirnproben im Alter von 42 (links) und 71 (rechts) Jahren zeigen. Weiße Kästchen zeigen den vergrößerten Bereich an (rechts). Die Bilder wurden mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Die DAPI-Färbung (blau) weist auf Kerne hin. Für die Immunhistochemie wurde ein humaner SQSTM1-spezifischer Antikörper verwendet. (A′) Quantifizierung der SQSTM1-Spiegel in menschlichen Gehirnproben in verschiedenen Erwachsenenstadien. SQSTM1 reichert sich in älteren Proben häufiger an als in jungen. (B) NeuN (grün)-MTMR14 (rot) doppelt immungefärbte Neuronen mit DAPI (blau) in der Schicht 3 des temporalen Kortex (BA 38) eines „jungen“ (oben, SKO20, 27 Jahre alt) und in einem „alten“ (unten, SKO18, 85 Jahre alten) Motiv, fotografiert mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop. NeuN-immunpositive Zellen sind grün, MTMR14-immunpositive Punkte (kleine weiße Pfeile) sind rot, Zellkerne sind blau. Weiße gepunktete Kästchen zeigen den vergrößerten Bereich (rechts), Bilder des rechten Panels zeigen den roten Kanal (MTMR14-Immunmarkierung). Gelbe Pfeilspitzen zeigen autofluoreszierendes Lipofuscin (violette Tropfen). Lipofuscin ist in beiden Proben vorhanden, beim „alten“ Probanden jedoch häufiger. MTMR14-markierte Punkte (rote Pfeilspitzen) sind in Zellkörpern und Dendriten sichtbar. Maßstabsbalken entsprechen 10 µm. (B′) Boxplot der durch MTMR14-Immunpositivität abgedeckten Fläche in Prozent der Zellfläche nach Fällen. Die MTMR14-Positivität wurde in den Zellen der 3D-Schicht von MTMR14-immungefärbten temporalen kortikalen Abschnitten gemessen. Die Darstellung zeigt, dass der Bereich der MTMR14-Immunopositivität bei älteren Probanden höher ist als bei jüngeren. Beachten Sie die in den meisten Fällen hohe individuelle Varianz zwischen den Zellen. Die sechs Probanden wurden in zwei Gruppen eingeteilt: „Jung-Mittelalter“ mit 27, 55 und 61 Jahre alten Probanden und „Alte“ mit 72, 77 und 85 Jahre alten Probanden. Die beiden Gruppen unterscheiden sich im T-Test deutlich. (C) Western-Blot-Analyse, die zeigt, dass sich MTMR14 mit zunehmendem Alter in menschlichen Kortexproben ansammelt. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. (C′) Quantifizierung der EDTP-Proteinspiegel in Gruppen mittleren und hohen Alters, bestimmt durch Western-Blot-Analyse (C). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. Statistiken finden Sie in Tabelle S1. (D) Die RT-qPCR-Analyse zeigt, dass die MTMR14-mRNA-Spiegel im menschlichen Kortex mit dem Alter ansteigen. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Verglichen wurden drei Personen mittleren Alters (47–58 Jahre) und drei Personen mittleren Alters (85–94 Jahre). Die Gruppen unterscheiden sich deutlich durch den Mann-Whitney-U-Test. Weitere Informationen zu den Proben finden Sie in Tabelle S5, ***P < 0,001. (E) RT-qPCR wurde durchgeführt, um die MTMR14-mRNA-Spiegel in Proben des präfrontalen Kortex zu bestimmen. Es wurden 9 junge (1–3 Jahre) Individuen und 6 alte (13–17 Jahre) Individuen verschiedener Rassen verglichen (Beispieldaten siehe Tabelle S6). Kommerzielle TaqMan-Assays wurden verwendet, um auf das MTMR14-Orthologe des Hundes abzuzielen (ThermoFisher, Cf02682018_g1). Als Referenzgen wurde GAPDH (Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase) verwendet (Cf04419463_gH). Im Diagramm stellen die Kästchen die typischsten 50 % der Proben dar, die Linien geben den Median an, die oberen und unteren Whisker zeigen die verbleibenden 25–25 % der Proben. Kreise markieren Ausreißer. **P < 0,01, unabhängiger T-Test bei zwei Stichproben. (F) Modell, das zeigt, wie EDTP/MTMR14-Lipidphosphatasen die Gehirnalterung beeinflussen. Die EDTP/MTMR14-Aktivität (rote Kurve) nimmt im Laufe des Erwachsenenlebens in Neuronen allmählich zu, wodurch die Autophagie mit zunehmendem Alter des Organismus zunehmend herunterreguliert wird (grüne Kurve). Als Folge häufen sich mit zunehmendem Alter Zellschäden in den Neuronen (graue Kurve). Grüne und graue gestrichelte Linien zeigen relative physiologische (Basal-)Werte der Autophagie bzw. der MTMR14/EDTP-Aktivität an. Die gelbe Linie zeigt relative 6-mA-Pegel am EDTP-Ort an. Im späteren Erwachsenenstadium wirken die beiden Lipidphosphatasen als endogene Pro-Aging-Faktoren.

In HeLa- und C2C12-Zellen (Maus-Myoblasten) wurde gezeigt, dass sich MTMR14 in autophagischen Strukturen lokalisiert22. Hier haben wir die Menge an MTMR14-positiven Partikeln in der Hirnrinde von menschlichen Patienten unterschiedlichen Alters getestet. Unter Verwendung eines humanen MTMR14-spezifischen Antikörpers wurde eine immunhistochemische Analyse durchgeführt, und die Ergebnisse zeigten, dass, ähnlich wie bei Drosophila, die Mengen an MTMR14-markierten Strukturen auch in Gehirnneuronen mit dem Alter ansteigen (Abb. 6B, B′ und). Tabelle S3). Diese Ergebnisse wurden durch eine parallele Analyse bestätigt, bei der ein anderer MTMR14-spezifischer Antikörper auf einen unabhängigen Satz von Gehirnproben von nicht dementen Patienten angewendet wurde (Abb. S7A, A′ und Tabelle S4). Eine anschließende Western-Blot-Analyse wurde weiter durchgeführt, um die löslichen MMR14-Spiegel in menschlichen Hirnrindenproben zu quantifizieren, und wir beobachteten viel höhere Intensitäten in gealterten Proben (85–94 Jahre) im Vergleich zu Proben mittleren Alters (47–58 Jahre) (Abb . 6C,C′, Abb. S7B und Tabelle S5). In diesen Proben wurden auch die MTMR14-Transkriptniveaus mithilfe einer qPCR-Analyse bestimmt. Den Ergebnissen zufolge wurde das Gen in alten Proben stärker exprimiert als in jungen (Abb. 6D, Abb. S7C und Tabelle S5). Daher kann die Transkriptionsregulation von MTMR14 zu einer erhöhten Konzentration (Aktivität) des Genprodukts im fortgeschrittenen Alter beitragen. Diese letztgenannten Ergebnisse korrelieren mit den bei GTExPORTAL (https://gtexportal.org) frei verfügbaren hirnrindenspezifischen Expressionsdaten des menschlichen Gehirns, denen zufolge MTMR14 bei beiden Geschlechtern mit zunehmendem Alter zunehmend exprimiert wird (Abb. S7D).

Um zu zeigen, dass die MTMR14-Expression einen altersbedingten Anstieg in der Hirnrinde einer anderen Säugetierart zeigt, haben wir schließlich die mRNA-Spiegel von MTMR14 bei jungen und älteren Hunden bestimmt (Abb. 6E und Tabelle S6). Die Ergebnisse zeigten, dass MTMR14 bei älteren Tieren aktiver ist als bei jungen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine geringere autophagische Aktivität in Neuronen im fortgeschrittenen Alter im Vergleich zum jungen Erwachsenenalter eine Folge der zunehmenden MTMR14-Akkumulation im Laufe des Lebens sein könnte.

In dieser Studie haben wir gezeigt, dass sich Drosophila Ref(2)P und menschliche p62-Proteine, die als Substrat für den autophagischen Abbau dienen, im Laufe des Alterns zunehmend im Gehirn ansammeln (Abb. 1B, B″″, C, C′ und 6A, A′). . Diese allmähliche Verschiebung der Ref(2)P/p62-Spiegel weist auf einen altersbedingten Rückgang der Fähigkeit zur Autophagie in diesem Organ hin und erklärt, warum Neuronen im späten Erwachsenenstadium zunehmend Zellschäden ansammeln und empfindlich auf Seneszenz und anschließend auf den Tod reagieren. Wir haben außerdem gezeigt, dass die Autophagie im fortgeschrittenen Alter in zwei verschiedenen Stadien beeinträchtigt wird. Erstens in einem frühen Stadium, wenn Phagophor/Autophagosom gebildet wird (Abb. 1B–B″). Zweitens, zu einem späteren Zeitpunkt, wenn das Autophagosom mit einem Lysosom verschmilzt oder der autolysosomale Inhalt durch saure Hydrolasen abgebaut wird (Abb. 1B–C″). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Beeinträchtigung der Autophagie im Alter zumindest teilweise auf einen regulatorischen (genetischen) Mechanismus zurückzuführen ist.

Autophagie spielt eine zentrale Rolle bei der Alterungskontrolle2,3,4,44. Es vermittelt die Beseitigung beschädigter zytoplasmatischer Bestandteile und seine Aktivität wird durch verschiedene, wenn nicht alle Langlebigkeitspfade beeinflusst, wie z. B. Insulin/IGF1 (insulinähnlicher Wachstumsfaktor) und TOR (Kinase-Ziel von Rapamycin), das mitochondriale Atmungssystem und der molekulare Apparat, der der Kalorienrestriktion zugrunde liegt43. Gene, die die Autophagie in gealterten Organismen herunterregulieren, tragen zweifellos zum Verfall von Organen und Geweben bei und fördern so die Entwicklung verschiedener altersbedingter degenerativer Erkrankungen. Die Funktionsweise dieser Regulierungssysteme hängt jedoch weitgehend von Umweltfaktoren wie Nahrungsverfügbarkeit, Sauerstoffkonzentration und Temperatur ab und beeinflusst die Autophagie auch in nicht alternden Zellen wie Keimbahn- und Krebsstammzellen, in denen der autophagische Abbau nicht stattfinden sollte unwiderruflich ab. Wir schlagen vor, dass in alternden somatischen Zellen bestimmte endogene Faktoren die Geschwindigkeit bestimmen sollten, mit der die Autophagiekapazität während des Alterns allmählich abnimmt, weitgehend unabhängig von Umwelteinflüssen. Ein solcher molekularer Uhrfaktor, der die Geschwindigkeit bestimmt, mit der Zellen altern, indem er die autophagische Aktivität moduliert, ist Rubicon, von dem kürzlich gezeigt wurde, dass er den Prozess über die Lebensspanne eines Erwachsenen in divergenten Tiertaxa zunehmend unterdrückt19.

Warum sollte die Autophagie in zahlreichen Neuronen im späten Erwachsenenstadium beeinträchtigt werden? Zusätzlich zu zufälligen inaktivierenden Mutationen in Atg-Genen können bestimmte genetische Faktoren die Autophagie bei älteren Erwachsenen negativ regulieren. Wir haben gezeigt, dass das EDTP-Gen, das für eine konservierte Myotubularin-verwandte Lipidphosphatase kodiert, die die Autophagie stört, indem es PI3K/Vps34 antagonisiert (Abb. 2A),23,25,34, während der Lebensspanne eines Erwachsenen auch zunehmend im Gehirn exprimiert wird (Abb. 4A, B). Mit zunehmendem Alter schien sich auch das EDTP-Protein in diesem Organ zunehmend anzureichern (Abb. 4C–C′). Seine Herunterregulierung in Neuronen löste signifikant Autophagie, eine verbesserte Fortbewegung und eine längere Lebensdauer aus (Abb. 5, Abbildung S3C-D′ und Abb. S4A′). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen wurde auch festgestellt, dass sich menschliches MTMR14 in menschlichen kortikalen Neuronen älterer Patienten im Vergleich zu jungen Patienten in höheren Konzentrationen ansammelt (Abb. 6B–C′, Abb. S7A–B′). Darüber hinaus nahm die MTMR14-Expression mit zunehmendem Alter zu (Abb. 6D, Abb. S7C, D). Bei Hunden wurde MTMR14 im präfrontalen Kortex des Gehirns bei alten Erwachsenen im Vergleich zu jungen Erwachsenen in ähnlicher Weise in erhöhten Konzentrationen exprimiert (Abb. 6E). Gemeinsam unterdrücken EDTP und MTMR14, ähnlich wie Rubicon, die Autophagie im Laufe des Lebens zunehmend19. Sowohl EDTP als auch MTMR14 erfüllen diese Funktion sowohl im frühen als auch im späten Stadium des autophagischen Prozesses (Abb. 1B–C″)22, während Rubicon dies ausschließlich im letzteren Fall tut19. Basierend auf diesen Daten kann man schlussfolgern, dass sich der Klasse-III-PI3K-Komplex, der durch das EDTP/MTMR14-Protein reguliert wird, möglicherweise als primäre molekulare Uhr entwickelt hat, bei der die Autophagie altersabhängig unterdrückt werden kann. Somit dient die Aktivität des Komplexes als Zeichen des Alterns.

Alterung, ein natürlicher Rückgang der Fitness und der allgemeinen Physiologie eines Organismus im Laufe der Zeit, wird durch die fortschreitende Anhäufung nicht reparierter Zellschäden vorangetrieben1,2,3,4,44. Der Prozess trägt zur Eliminierung postreproduktiver Erwachsener aus Populationen bei und verringert dadurch die intraspezifische Konkurrenz unter Bedingungen begrenzter Ressourcen. Somit kann die Entstehung genetischer Faktoren, die das Altern fördern, die langfristige Existenz von Arten auf Kosten des individuellen Lebens stärken. Im Zuge der Alterung von Organismen kommt es durch den allmählich zunehmenden Zerfall neuronaler Funktionen zu einer zunehmenden Einschränkung der Überlebensfähigkeit des Einzelnen. In dieser Studie haben wir einen neuartigen Regulierungsmechanismus entdeckt, durch den sich das Gehirn im Laufe des Erwachsenenlebens immer schneller verschlechtert. Wir haben gezeigt, dass Drosophila EDTP und menschliches MTMR14, zwei konservierte negative Regulatoren des autophagischen Prozesses 22, 23, 34, sich im Laufe des Erwachsenenalters zunehmend in Gehirnneuronen ansammeln (Abb. 4, 6B–C′). Daher fungieren diese orthologen Proteine, nachdem sie in einem bestimmten Erwachsenenstadium ein kritisches Akkumulationsniveau in Neuronen durchlaufen haben, als endogene Pro-Aging-Faktoren, die die Alterung des Gehirns fördern und die Lebensdauer einschränken, indem sie die Autophagie im Laufe der Zeit zunehmend herunterregulieren (Abb. 6F). Aufgrund der abnehmenden autophagischen Kapazität reagieren Neuronen immer empfindlicher auf die Anhäufung von Zellschäden und infolgedessen auf den Tod im Laufe des Erwachsenenlebens.

Die konservierten MTMR-Lipidphosphatasen EDTP und MTMR14 wirken als endogene Faktoren, die die autophagische Aktivität im Laufe des Lebens zunehmend senken und stellen somit eine neue Klasse endogener alterungsfördernder regulatorischer Faktoren dar. Die Funktion von EDTP und MTMR14 bei der Alterungskontrolle scheint der von Rubicon19 ähnlich zu sein. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die in dieser Studie präsentierten Daten einen neuartigen Mechanismus offenbaren, der die Alterung des Gehirns vorantreibt. Wir vermuten, dass die allmählich zunehmende Empfindlichkeit von Neuronen gegenüber dem Absterben während des Alterns genetisch bedingt ist. Die Alterung des Gehirns ist zumindest teilweise ein regulierter Prozess, und die Entwicklung einer neurodegenerativen Erkrankung ist lediglich eine Frage der Lebenszeit des Einzelnen.

Zuvor haben wir herausgefunden, dass sowohl EDTP als auch Mtmr6, die Fliegenorthologen von Säugetier-MTMR14 bzw. MTMR6-8, bei der Kontrolle der Autophagie eine Rolle spielen21,45,46. Diese Proteine ​​üben ihre regulatorische Rolle zustandsabhängig im Fettkörper der Larve (L3F-Stadium) aus; EDTP hemmt die basale Autophagie, beeinflusst jedoch nicht die stressinduzierte Autophagie, während Mtmr6 die basale Autophagie fördert, den Prozess jedoch unter verschiedenen Stressbedingungen hemmt. Bei Säugetieren wandeln MTMR14 und MTMR8 jeweils PI3P in PI um, während MTMR6 die PI(3,5)P2-Erzeugung blockiert38. Sowohl unter hungernden als auch unter nährstoffreichen Bedingungen hemmt MTMR14 die Autophagie, während MTMR6 die durch Hunger hervorgerufene Autophagie nur beeinflusst 22. Somit spielen MTMR14 und MTMR6 in verschiedenen Modellsystemen unterschiedliche Rollen. In Zukunft lohnt es sich, die funktionellen Zusammenhänge dieser Proteine ​​im Nervensystem des Erwachsenen und bei der Bestimmung der Lebensspanne zu untersuchen.

Die Fliegen wurden bei 25 °C oder 29 °C mit normalem Fliegenmaismehl-Nährstoff gehalten. Die Stämme wurden beim Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) und beim Drosophila Genetic Resource Center, Kyoto (DGRC) bestellt oder freundlicherweise von einem anderen Forscher zur Verfügung gestellt oder von uns zuvor generiert und beschrieben.

Für die Immunhistochemie und Fluoreszenzmikroskopie wurden w[1118] (BDSC: 5905) bzw. UAS-GFP-2xFYVE (II) (BDSC: 42712) Tiere (gekreuzt mit Appl-Gal4) verwendet. Die endogene GFP-Atg8a-Expression wurde in Lit. 31 beschrieben.

Für die Western-Blot-Analyse wurde w[1118] als Kontrolle verwendet. Für die EDTP-Überexpression wurde EDTP[GSV6] (DGRC: 202239) unter der Kontrolle von Appl-Gal4 (BDSC: 32040) verwendet. EDTP[MI008496] (BDSC: 44782) wurde als hypomorphes Allel verwendet.

Tiere von w[1118]; 3xmCherry-Atg8 ist w[1118]; + ; UAS-GFP-Lamp1-Genotypen wurden von Gábor Juhász (Eötvös-Loránd-Universität Budapest, Ungarn) bereitgestellt. Für Lebensdauertests: y[1] v[1], Appl-Gal4; EDTP TRiP /tubGal80[ts] und y[1] sc[*]v[1], Appl-Gal4; eGFP TRiP /tubGal80[ts] (Kontrolltiere) wurden durch Kreuzung von Appl-Gal4, tubGal80[ts];TM2/TM6B (BDSC: 7108), eGFPTRIP (V22) (BDSC: 41550) und EDTP TRIP (V22) (BDSC) erzeugt : 41633) Tiere. Im Falle eines anderen Lebensdauertests und für Klettertests werden Tiere mit w[1118]/+; +; pleGal4/+ und w[*]/+; +; UAS-EDTP-RNAi/pleGal4-Genotypen wurden durch Kreuzung von pleGal4 (BDSC: 8848), w[1118], eGFPTRiP (V22), EDTP TRiP (V22) und w[*] erzeugt; UAS-EDTP-RNAi (III)-Tiere, die ein Geschenk von Tamás Lukácsovich (Abteilung für Entwicklungs- und Zellbiologie, University of California, Irvine, CA, USA) waren und in Manzéger et al.47 beschrieben wurden. Die Fliegen wurden bei 29 °C gehalten und die toten Tiere wurden täglich gezählt.

Für Lebensdauermessungen, Klettertests und Protein-Ubiquitinierungstests wurden zwei verschiedene RNAi-Konstrukte verwendet, um die EDTP-Expression herunterzuregulieren. Der Stamm BDSC: 41633 (EDTP-RNAi(V22)) enthält eine kürzere Zielsequenz: CAG TAG TGT AAT AGT AAT CAA (Abb. S2B), während das andere Konstrukt (EDTP-RNAdsRNA) eine längere, aber andere Zielsequenz enthält (Abb. S2B): ctc gag GGT ACC GGG AAA TGG ACT CTT CGG GCA AGT TGG GGG AGT GGG AGG TGG AGG CTC CTC GGG AAC AAC CGC CAC TGC CAC GCC TCT GAA CAG CAG TGC AGG AAG CAC CGG AAG TGA GGG TGT GGG CAT CCA AGC CTT TGT GAC CTT TGC CAA TCC CCT GCA GAC GCA ACA ACA GCA TCC GCT CCA GCA ACA ATA TCC CTC GCA GCA GAT GCA TCC CCT CCA CGC GCA ATA TCC CTC CCA GCA GCC ACA TCC ACT CCA GCA GCA GCA GCA GCA GCC ATC GCA ACA GCA ACC ACA AAA TAC GAT ATA CGA GGA TCA GTA TGA TAT CCA GCG AAT GCG GGA ATT GGT AAC GAT GGC CAA ATA TGC GAG ATG CCG TCA AAG ATT CGC CGT GCC TGT GAT TAT GTA TCG CGG AAA GTA CAT ATG CCG CTC TGC CAC GCT ATC CGT CAT GCC AGA AAC CTA CGG CCG AAA AGT GGT GGA CTA TGC CTA CGA CTG CCT GAG TGG CGG CAA TTA CAC CGC GCC AAA CGG AGA AGA GAA CGA TGC TGA CTC CAC GGA CGA GTC GCT GAT CAC CCA CAT GCA CGA CCA GGC GCA GTC GCA GTT CAG CTA CGA CGA AGT CAT CAA GAG TGA CAT CCA GCT GCT GCA TAC GCT CAA TGT CTC AAC CAT TGT GGA CCT CAT GGT CGA AAA CCG CAA AAT CAA ATA CTT CAT GGC aga tct.

Zum Studium der EDTP-Expression: y[1] w[*]; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{y[+ t7.7] w[+ mC] = 10XUAS-IVS-myr::GFP}su(Hw)attP5 und y[1 ] w[*]; Mi{Trojan-GAL4.0}EDTP[MI08496-TG4.0]/ P{w[+ mC] = UAS-GFP.nls}14 Tiere wurden durch Kreuzung von EDTP TrojanGal4 (BDSC: 66899), UAS-myrGFP (BDSC : 32199) und UAS-GFPnls (BDSC: 4775) Stämme. Zur Messung mCherry-Atg8a-markierter autophagischer Strukturen wurde das UAS-mCherry-Atg8a-Transgen verwendet, das freundlicherweise von Gábor Juhász (Abteilung für Anatomie, Zell- und Entwicklungsbiologie; Eötvös-Loránd-Universität, Budapest, Ungarn) zur Verfügung gestellt und in Ref. 48 beschrieben wurde.

Zur Bestimmung der Atg8a-Spiegel wurde ein GFP-Atg8a-Reporterkonstrukt (p-Atg8a-eGFP-Atg8a) verwendet31. Den Proben wurde 4 % Formaldehyd (gelöst in PBS) vorfixiert und dreimal (10 Minuten lang) in PBS gewaschen. Die Kerne wurden mit 50 µg Hoechst in Glycerin:PBS (4:1) Abdecklösung gefärbt. Bei der Messung verwendeten wir für alle Proben die gleiche Belichtungszeit und Vergrößerung.

Fixierung und Immunhistochemie wurden gemäß Ref. 46 durchgeführt. Die folgenden Antikörper wurden verwendet: Anti-Ref(2)P 1:200, Kaninchen – ein Geschenk von Gábor Juhász, Abteilung für Anatomie, Zell- und Entwicklungsbiologie, Eötvös-Loránd-Universität, Budapest, Ungarn49 und Anti-Atg5 (1:500). , Kaninchen, Sigma Aldrich, AV54267), Anti-Ubiquitin (1:500, Maus, Merck, ST1200). Die folgenden Sekundärantikörper wurden verwendet: Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 488 (1:500, Life Technologies, A11008), Anti-Maus-Alexa-Fluor 488 (1:500, Life Technologies, A11001). Die Kerne wurden mit Hoechst-Farbstoff (0,1 mg/ml, Molecular Probes, 33342) gefärbt.

Fluoreszenzbilder wurden mit einem aufrechten Zeiss Axioimager Z1-Mikroskop (mit Objektiven Plan-NeoFluar 10 × 0,3 NA, Plan-NeoFluar 40 × 0,75 NA und Plan-Apochromat 63 × 1,4 NA), ausgestattet mit ApoTome, und einem konfokalen Nikon C2-Mikroskop (mit Ziel 60 × Ölplan APO VC NA = 1,45). Zur Untersuchung und Auswertung der gewonnenen Daten wurden die Software AxioVision 4.82 und Jmage J 1.52c verwendet. Wir haben die Pearson-Koeffizienten mit Bild J 1.52c berechnet, um die Kolokalisierung von mCherry-Atg8a- und GFP-Lamp1-Partikeln zu bewerten.

Western-Blot-Proben wurden von 10 weiblichen Köpfen hergestellt, die in 32 μl Fly Lysis-Puffer + 32 μl 2 × Laemmli-Puffer behandelt wurden. 15-µl-Proben wurden auf 4–20 % Mini-PROTEAN® TGX™ Gel laufen gelassen und auf eine Nitrozellulosemembran (Kisker Biotech, 40520100) geblottet. Nach dem Blockieren mit 3 % Milchpulver (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/), gelöst in TBST, wurden die Membranen mit spezifischen Antikörpern sondiert [Anti-Tubulin (1:1000, Maus, Sigma T6199), Anti-Ref(2) P (1:2000, Kaninchen48), Anti-Atg8a (1:2500, Kaninchen50), Anti-EDTP, 1:1000, Ratte22, Anti-Maus-IgG-alkalische Phosphatase (1:1000, Sigma, A8438) und Anti-Kaninchen IgG-alkalische Phosphatase (1:1000, Sigma, A3687), Anti-Ratten-IgG-alkalische Phosphatase (1:1000, Sigma, A5153) und entwickelt mit NBT-BCIP-Lösung (Sigma, 72091). Jede Western-Blot-Analyse wurde mindestens dreimal mit unabhängigen biologischen Proben wiederholt.

Die Isolierung der Gesamt-mRNA aus Köpfen erwachsener Fliegen im Alter von 1, 10, 20, 30, 40, 50 und 60 Tagen wurde gemäß dem Protokoll des Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit (Zymo Research, R2050) durchgeführt, anschließend wurde cDNA generiert von RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Scientific, K1691). Quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionen wurden in einem Roche LightCycler 96 Instrument (Roche Molecular Systems) mit dem FastStat Essential DNS Green Master Kit (Roche, 06924204011) durchgeführt. Quantitative Messungen wurden dreimal mit neu isolierten Proben wiederholt, und jedes qPCR-Experiment enthielt drei technische Wiederholungen. Als innere Kontrolle wurde der GAPDH-mRNA-Spiegel verwendet. Die Vorwärts- (F) und Rückwärts- (R) Primer waren wie folgt: EDTP F: 5′-AAA AAG CTC CGG GAA AAG G-3′ und R: 5′-AAT TCC GAT CTT CGA CAT GGC-3′, GAPDH F: 5′-TAC TTC ATG GCC GTT TCC TC-3′ und R: 5′-AGA TCC CAA TCC CGG TAC TC-3′.

Genomische DNA wurde aus Drosophila in verschiedenen Erwachsenenstadien gemäß Standardprotokollen (Thermo Scientific GeneJET Genomic DNA Purification Kits #K0721 und #K0722) isoliert. Die Proben wurden mit DpnI 20 Minuten lang bei 37 °C verdaut, dann wurde das Enzym 20 Minuten lang bei 80 °C inaktiviert, dann wurde ein PCR-Experiment wie zuvor von Yao et al.42 beschrieben durchgeführt. Vorwärts- und Rückwärtsprimer sowie PCR-Bedingungen waren wie folgt. Für Drosophila, Kontrolle: 5′-TGA GGA ACA TCA TTC TTG GCT C-3′ und 5′-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3′; 6mA EDTP: 5′-ACC GTT AGG TCA GAT CTA TCC AG-3′ und 5′-CTA CGG GGA GCT GAT GTA CT-3′. PCR: 95 °C für 30 s, dann 95 °C für 10 s und 58,8 °C für 30 s, wiederholt mit 30/50 Zyklen (Kontrolle/Probe).

20 erwachsene Fliegen (die bei 29 °C gezüchtet wurden), die das Transgen unter der Kontrolle des pleGal4-Treibers exprimierten, wurden anästhesiert und in eine vertikale Glassäule (Länge 25 cm; Durchmesser 1,5 cm) gegeben. Nach einer einstündigen Erholungsphase von der CO2-Exposition wurden die Fliegen fünfmal sanft auf den Boden der Säule geschlagen. Gezählt wurde die Anzahl der Fliegen, die innerhalb von 20 s die Linie bei 21,8 cm Höhe erreichten. In jedem Experiment wurden drei Serien von zwei parallelen Messungen durchgeführt. Die Ergebnisse stellen die durchschnittliche Anzahl der Fliegen dar, die die Spitze erreicht haben, verglichen mit der Gesamtzahl der getesteten Fliegen. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SD dargestellt

Für die Lebensdauermessungen wurde eine äquivalente Anzahl von Männern und Frauen verwendet. Die Tiere wurden jeden zweiten Tag in frische, nährstoffhaltige Fläschchen überführt. Die Zahl der toten Tiere wurde täglich gezählt. Die Messungen wurden mit fünf Parallelen durchgeführt. Die Tests wurden bei 25 und 29 °C durchgeführt.

Für die statistische Analyse von Klettertests, Lebensdauermessungen (mittlere Lebensdauer) und Fluoreszenzmikroskopie wurden die Ergebnisse mit R Studio (Version 3.4.3) ermittelt. Die Verteilung der Proben (normal oder nicht) wurde mit dem Lilliefors-Test getestet. Wenn es normal war, wurde ein F-Test durchgeführt, um die Varianzen zu vergleichen. In Fällen, in denen die Varianzen gleich waren, wurde der T-Test bei zwei Stichproben verwendet, andernfalls wurde der T-Test für ungleiche Varianzen angewendet. Im Falle einer nicht normalen Verteilung wurde ein Mann-Whitney-U-Test durchgeführt. Für die Lebensdauerkurvenstatistik wurde die Logrank-Methode (Mantel-Cox) verwendet, berechnet mit dem Programm SPSS17.0.

Ubiquitinierte Proteine ​​im autophagisch-endozytotischen Weg und eine Beeinträchtigung der Autophagie wurden durch immunhistochemische Lokalisierung des Anti-Myotubulerin-verwandten Phosphatase-MTMR14-Antikörpers beobachtet. Nach der Entparaffinierung und Rehydratisierung wurden die Schnitte zur Antigengewinnung 2 Minuten lang in einer 0,01 M Citrat-Pufferlösung (pH 6,0) in einem Mikrowellenofen (bei 900 Watt eingestellt) gekocht. Nach der Blockierung der endogenen Peroxidase in 0,1 M TBS mit 3 % H2O2 für 10 Minuten bei 37 °C wurden die Schnitte 3–5 Minuten lang in 0,1 M TBS (pH 7,4) bei RT gewaschen. Als nächstes wurden Gewebeschnitte permeabilisiert und die Hintergrundbindung von Antikörpern in einer Blockierungslösung (0,1 M TBS, enthaltend 5 % normales Ziegenserum, 1 % BSA, 0,05 % Triton X-100) 30 Minuten lang bei 37 °C reduziert. Die Schnitte wurden mit der obigen Lösung bedeckt, die entweder Maus-Anti-NeuN-Primärantikörper (1:500 Endverdünnung; Chemicon, Billerica, MA, USA) oder polyklonalen Kaninchen-Anti-MTMR14-Primärantikörper (1:100 Endverdünnung; ab102575, Abcam, Cambridge) enthielt , UK) über Nacht bei 4 °C. Nach der Inkubation mit den primären Antikörpern wurden die Schnitte 4 × 5 Minuten lang in 0,1 M TBS (pH 7,4) bei RT gewaschen. Negativkontrollexperimente wurden durchgeführt, wenn der entsprechende Primärantikörper weggelassen wurde. Die Schnitte wurden dann 5 Stunden lang entweder mit biotinyliertem Anti-Kaninchen- oder Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper (Endverdünnung 1:200; Amersham Biosciences, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) in einer Blockierungslösung (wobei Triton X-100 weggelassen wurde) behandelt bei RT. Nach mehreren Wäschen (4 × 5 Minuten) wurde biotinylierter Streptavidin-Peroxidase-Tertiärantikörper (1:200 Endverdünnung; Amersham) in einer Blockierungslösung (ohne Triton X-100) über Nacht bei 4 °C auf die Schnitte aufgetragen. Die Schnitte wurden erneut 4 × 5 Minuten lang bei RT in 0,1 M TBS (pH 7,4) gewaschen und für die Peroxidase-Enzym-Histochemie unter Verwendung von Sigma Fast DAB Tablet (Sigma, St. Louis, MO, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers verarbeitet. Die Schnitte wurden 3 × 5 Minuten lang in 0,1 M TBS (pH 7,4) bei RT gewaschen, 1 Minute lang in destilliertem Wasser gespült, in einer Reihe von Ethanollösungen dehydriert, mit DPX-Eindeckmedium (Fluka, 30 Buchs, Schweiz) bedeckt und mit einem Deckglas versehen .

Digitale Bilder von Abschnitten des Schläfenkortizes von 4 nicht dementen Probanden (Alter, Geschlecht, postmortale Verzögerungen und Braak-Stadien siehe Tabelle S4), die auf NeuN immungefärbt waren, wurden mit einem Leica DMLB-Lichtmikroskop (Leica Microskopie und Systeme GmbH; Wetzlar, Deutschland) mit einer Qimage MicroPublisher 3.3 RTV-Digitalkamera (Surrey, BC, Kanada). NeuN-positive Zellen (nicht gezeigt) wurden mit dem Computerprogramm ImageJ (Version 1.47; entwickelt von W. Rasband am US National Institutes of Health und verfügbar im Internet unter http://rsb.info.nih) gezählt. gov/ij), wie wir zuvor veröffentlicht haben (Einzelheiten siehe Ref. 35,51). MTMR14-Immunreaktivitäten wurden in lipofuscinfreiem Zytoplasma mithilfe der Bildverarbeitungssoftware ImageJ quantifiziert. Insgesamt wurden 134 Zellen aus nicht dementen Proben analysiert. Messungen wurden von zwei unabhängigen Forschern aufgenommen und die Dichtewerte gemittelt.

Die Proteinverteilung wurde mithilfe von Immunfluoreszenztechniken unter Verwendung der Fluorophor-Tyramid-Signalverstärkungsmethode (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA) gemessen. Zur Vorbereitung der Objektträger für die Färbung wurde ein BOND-RX-Färbeautomat (Leica Biosystems, Wetzlar, Deutschland) verwendet. Die Schnitte wurden „gebacken“ (30 Min. bei 60 °C), mit Bond Dewax Solution (Leica Biosystems, 72 °C) entparaffiniert und einem hitzeinduzierten Epitop-Retrieval-Schritt (EDTA-basierte Lösung, pH 9,0, 20 Min. bei …) unterzogen 100 °C).

Nach dieser „Vorbehandlung“ wurden die Objektträger manuell in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, 30 Minuten lang in 0,03 % H2O2 inkubiert, um endogene Peroxidase zu blockieren, und erneut gewaschen. Primärer Kaninchenantikörper gegen menschliches SQSTM1 (HPA003196, Atlas Antibodies, Stockholm, Schweden), 1:10 in primärem Antikörperpuffer (0,3 % TX-100, 0,1 % NaN3, PBS) verdünnt und zur Inkubation über Nacht in einer befeuchteten Kammer auf die Objektträger gegeben bei 4 °C. Am folgenden Tag wurden die Objektträger in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, pH 7,4) – Tween 20 gewaschen und in Tris-NaCl-Blockierungspuffer (TNB) (0,1 mol/l Tris-HCl, pH 7,5, 0,15 mol/l NaCl) blockiert , 0,5 % Blockierungsreagenz, Perkin Elmer) für 30 Min. Anschließend wurde der sekundäre Schweine-Anti-Kaninchen-HRP-Konjugat-Antikörper (DAKO), 1:200 in TNB verdünnt, 30 Minuten lang auf die Objektträger aufgetragen und anschließend in TBS-Tween 20 gewaschen. Für das Tyramidsignal wurden die Amplifikationsobjektträger mit Fluorescein-konjugiertem Tyramid inkubiert verdünnt (1:100) in Amplifikationsreagenz (Perkin Elmer) für 15 Minuten bei Raumtemperatur.

Um die Autofluoreszenz von Lipofuscin im Gewebe zu löschen, wurden die Objektträger 5 Minuten lang mit lipophiler Sudan Black B-Lösung (1 % w/v in 70 % Ethanol, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gegengefärbt. Die Objektträger wurden dann in 70 % Ethanol getaucht, anschließend mit PBS gewaschen und mit einem wässrigen Eindeckmedium abgedeckt, das eine 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI)-Gegenfärbung enthielt (ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). Sofern nicht anders angegeben, wurden alle Schritte bei Raumtemperatur durchgeführt.

Die Bilder wurden mit einem automatisierten VSlide-Objektträgerscansystem (Metasystems, Altlußheim, Deutschland) aufgenommen. Ganze Gewebestücke auf den Objektträgern wurden mit einem 20-fach-Objektiv (NA = 0,45, Auflösung 3,6 Pixel/μm) abgebildet. Jedes Sichtfeld wurde auf 3 Z-Ebenen mit einem Intervall von 1 μm erfasst, um ein Bild mit erweitertem Fokus zu erstellen. Die erfassten Sichtfeldbilder wurden zusammengefügt, um eine vollständige Übersicht mit mikroskopischer Auflösung zu erstellen. Die Emissionsspektren für die Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper waren wie folgt: Hoechst (420–485 nm), Cy2 (490–530 nm), Cy3 (550–570 nm), Cy3.5 (580–595 nm) und Cy5 (650–670 nm).

Gesamte menschliche mRNA-Proben wurden gemäß dem Direct-zol™ RNA MiniPrep Kit-Protokoll (Zymo Research, R2050) aus den temporalen kortikalen Geweben isoliert, anschließend wurde cDNA mit dem RevertAid RT Reverse Transcription Kit (Thermo Scientific, K1691) generiert. Für quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionen wurde das Roche LightCycler 96 Instrument (Roche Molecular Systems) mit dem FastStat Essential DNS Green Master Kit (Roche, 06924204011) verwendet. GAPDH wurde als interne Kontrolle verwendet. Die folgenden Vorwärts- und Rückwärtsprimer wurden verwendet: GAPDH: 5'-TCG GAG TCA ACG ATT TGG T-3' und 5'-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3', MTMR14: 5'-GTA ACG GGC TGT GGC AGT AT-3′ und 5′-TTC CCG TTC TCA GCC TTG AC-3′.

Proteine ​​wurden aus temporalen kortikalen Geweben gemäß dem Standardprotokoll zur Probenvorbereitung für den Western-Blot von Abcam isoliert. Pro Probe wurden 15 mg Gewebe in 600 µl Lysepuffer (einschließlich RIPA-Puffer und Protease- und Phosphataseinhibitoren) mit einem elektrischen Homogenisator homogenisiert. 20-µl-Proben wurden auf 4–20 % Mini-PROTEAN® TGX™ Gel laufen gelassen und auf eine Nitrozellulosemembran (Kisker Biotech, 40520100) geblottet. Nach dem Blockieren mit 3 % Milchpulver (BioRad 170-6404 /Blotting-Grade Blocker/), gelöst in TBST, wurden die Membranen mit spezifischen Antikörpern sondiert [Anti-GAPDH (1:2000, Kaninchen, Sigma G9545), Anti-MTMR14 (1: 500, Kaninchen, Abcam ab102575), Anti-Kaninchen-IgG-alkalische Phosphatase (1:1000, Sigma, A3687) und entwickelt mit NBT-BCIP-Lösung (Sigma, 72091).

Menschliches temporales Kortikaliskontrollgewebe wurde von fünf Männern und einer Frau gewonnen (SKO20: 27 Jahre alt, SKO7: 55 Jahre alt, SKO19: 61 Jahre alt, SKO11: 77 Jahre alt, SKO16: 72 Jahre alt). 18 Jahre alt, SKO18: 85 Jahre alt) starben an Ursachen, die nicht mit einer Hirnerkrankung in Zusammenhang standen, und hatten in der Vorgeschichte keine neurologischen Störungen. Kontrollpersonen wurden zur Autopsie in der Abteilung für Pathologie des St. Borbála-Krankenhauses in Tatabánya, Ungarn, bearbeitet. Die Gewebe wurden im Einklang mit der Deklaration von Helsinki gewonnen und verwendet. Alle Verfahren wurden vom regionalen und institutionellen Ausschuss für Wissenschafts- und Forschungsethik des Wissenschaftlichen Rates für Gesundheit gemäß dem ungarischen Gesetz (ETT TUKEB 15032/2019/EKU) genehmigt.

Gehirnproben wurden 2–4, 5 Stunden nach dem Tod entnommen, sowohl die inneren Halsschlagadern als auch die Wirbelarterien wurden mit einer Kanüle versehen und zunächst mit physiologischer Kochsalzlösung (1,5 l in 30 Minuten) mit 5 ml Heparin perfundiert, gefolgt von einer Fixierlösung mit 4 % Heparin. Paraformaldehyd, 0,05 % Glutaraldehyd und 0,2 % Pikrinsäure in 0,1 M PB, pH 7,4 (4–5 l in 1,5–2 h). Der temporale Kortex wurde nach der Perfusion entfernt und über Nacht in derselben Fixierlösung, jedoch ohne Glutaraldehyd, nachfixiert52. Anschließend wurden aus den Blöcken mit einem Leica VTS-1000 Vibratome (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) 60 µm dicke koronale Schnitte für die Immunhistochemie hergestellt. Die Schnitte wurden in PB gewaschen und 1–2 Tage lang in 30 % Saccharose getaucht und dann dreimal über flüssigem Stickstoff eingefroren und aufgetaut. Die Schnitte wurden für die Immunfärbung wie folgt verarbeitet: Nach fünfmaligem gründlichen Waschen in PB wurde die endogene Peroxidaseaktivität durch 1 % H2O2 in TRIS-gepufferter Kochsalzlösung (TBS, pH 7,4) für 10 Minuten blockiert. TBS wurde für alle Waschgänge (3 × 10 Minuten zwischen jedem Antiserum) und zur Verdünnung der Antiseren verwendet. Für konfokalmikroskopische Untersuchungen erfolgte die Inkubation von Primärantikörpern gleichzeitig (Anti-MTMR14, Kaninchen, 1:500; ABCAM, #ab102575), Anti-NeuN, Maus, 1:2000; Merck, #Ab377). Nach der Inkubation wurden sekundäre Antikörper mit Fluorophoren aufgetragen (DAM Alexa488 1:500; Thermofisher, #A-2107, DAR Alexa594 1:500; Thermofisher, #A-2102) für 3 Stunden, dann wurden die Proben mit DAPI-Fluorophor inkubiert (1: 10.000, Sigma-Aldrich, #D9564) für 2 Stunden. Zur Reduzierung der Autofluoreszenz wurden die Proben 40 Minuten lang mit CuSO4-Lösung inkubiert oder die Proben 5 Minuten lang mit AER (Autofluoreszenz-Eliminator-Reagenz; Merck, Nr. 2160) in 70 % Ethanol behandelt. Danach wurden die Proben in Aqua-Poly/Mount (Polysciences, Nr. 18606-20) montiert. Um eine Wechselwirkung mit zusätzlichen Chemikalien zu vermeiden, die zu einer verringerten Fluoreszenzintensität führt, wurde die quantitative Messung ohne AER durchgeführt. Die Proben wurden mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop Nikon C2 mit 60-fachen Ölobjektiven analysiert. ROI-Bereiche (Region of Interest) wurden aus der Gesamtbreite der kortikalen Schicht 3 aus temporalen kortikalen Abschnitten (Brodmann-Bereich 38) definiert. NeunN-markierte Zellen wurden in ihrer größten perikaryalen Ausdehnung fotografiert. Mit dieser Methode werden ca. 30 Zellen wurden aus der 3D-Schicht jeder kortikalen Probe fotografiert. Dreifach fluoreszierende konfokale NeuNm/MTMR14r/DAPI-Bilder wurden mit dem Programm ImageJ 1.50b analysiert. Bei den Messungen wurden die drei Kanäle (grün: 488 nm; rot: 594 nm; blau: DAPI 470 nm) getrennt visualisiert. Zytoplasmabereiche ohne Kern oder autofluoreszierendes Lipofuszin wurden mithilfe der Kanäle NeuN (grün) und DAPI (blau) bestimmt. In diesen Zellen wurden ein oder zwei 2–4 µm2 große ROI-Bereiche ausgewiesen. Die Intensität wurde in ROI-Bereichen im roten Kanal gemessen, die der MTMR14-Immunmarkierung entsprechen. Obwohl die Bildgebungsparameter einheitlich waren, waren die absoluten Intensitätswerte aufgrund individueller Unterschiede in den Proben nicht vergleichbar, sodass für jede einzelne Zelle eine relative Intensitätseinheit (IU) ermittelt wurde. Als Referenzintensität wurde die relative Intensität (gemessen wie oben beschrieben) von Gliazellen neben Neuronen verwendet. Die relative Intensität wurde anhand der folgenden Formel berechnet: IU = (AI-RI)/(MI-RI) × 100, wobei AI die im Zytoplasma von Neuronen gemessene absolute Intensität ist, RI die Referenzintensität und MI die höchste ist Intensität im Bild gefunden. Für Bilder ohne identifizierbare Gliazellen wurde der Durchschnitt der RI-Werte der Bilder des Probanden zur Berechnung herangezogen. Für die Statistik wurde das Diagrammprogramm Statistica 13.4 von Microsoft Excell verwendet. Die sechs Probanden wurden in zwei Gruppen eingeteilt: „jung“ mit den 27, 55 und 61 Jahre alten Probanden und „alt“ mit den 72, 77 und 85 Jahre alten Probanden. Die Normalität der erhaltenen IU-Werte wurde durch den Kolmogorov-Smirnov-Test überprüft. Basierend auf P > 0,2-Werten waren die Daten normalverteilt, sodass gepoolte Intensitätseinheitsdaten der beiden Gruppen per T-Test verglichen wurden.

Die Gesamt-RNA wurde aus in RNAlater (Thermo Fisher Scientific, Nr. AM7021) gefroren gelagerten frontalen Kortikalisproben von Hunden unter Verwendung von TRIzol (ThermoFisher Scientific, Nr. 15596018) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Vor dem Eintauchen der Gewebestücke in TRIzol wurde jedes Stück in einem neuen Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS gespült und 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Den Proben wurde TRIzol zugesetzt, nachdem PBS entfernt worden war. Gewebestücke wurden in TRIzol mit einem Ultra-Turrax-Homogenisator (Ika) homogenisiert. Nach der Homogenisierung erfolgte die RNA-Isolierung. Die Qualität der Isolate wurde durch Agarosegelelektrophorese überprüft und die Konzentrationen wurden mit einem NanoDrop-Gerät (ThermoFisher Scientific) gemessen. Isolierte RNA-Proben wurden vor der cDNA-Synthese bei –20 °C und für die Langzeitlagerung bei –80 °C gelagert.

1000 ng Gesamt-RNA wurden mit dem Maxima RevertAid cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Nr. K1672) revers in cDNA transkribiert. Die reverse Transkription wurde unter Verwendung zufälliger Hexamer-Primer durchgeführt. Anschließend wurden die cDNA-Proben in nukleasefreiem Wasser zehnfach verdünnt und entweder bei –20 °C oder –80 °C aufbewahrt. Quantitative Echtzeit-PCR-Reaktionen wurden in einem Roche LightCycler 96 Instrument (Roche Molecular Systems) unter Verwendung kommerzieller TaqMan-Assays und TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Nr. 4369514) durchgeführt. Die Hundeorthologen von MTMR14 und GAPDH (interne Kontrolle) sind Cf02682018_g1 bzw. Cf04419463_gH. Die Reaktionen wurden dreifach in Platten mit 96 Vertiefungen durchgeführt.

Verfahren, die Experimente an Wirbeltiersubjekten beinhalteten, wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden der Eötvös-Loránd-Universität, Budapest, Ungarn, durchgeführt. Wir bestätigen, dass die im Manuskript dargestellten Studien in Übereinstimmung mit den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt wurden.

Der Umgang mit tierischen und menschlichen Gehirnproben erfolgte gemäß den Richtlinien des Ausschusses für Humanexperimente der Universität Szeged, der Fakultät für Medizin und der Fakultät für Naturwissenschaften und Informatik (Szeged, Ungarn) sowie des Instituts für Experimentelle Medizin der Ungarischen Akademie der Wissenschaften (Budapest, Ungarn), in dem die Experimente durchgeführt wurden. Wir bestätigen, dass von allen Probanden und/oder ihrem Erziehungsberechtigten eine informierte Einwilligung eingeholt wurde (für die Verwendung ihrer Daten in unserem Manuskript).

Der Umgang mit tierischen und menschlichen Gehirnproben erfolgte gemäß den Richtlinien des Ausschusses für Humanexperimente der Universität Szeged, der Fakultät für Medizin und der Fakultät für Naturwissenschaften und Informatik (Szeged, Ungarn) sowie des Instituts für Experimentelle Medizin der Ungarischen Akademie der Wissenschaften (Budapest, Ungarn), in dem die Experimente durchgeführt wurden. Die während der aktuellen Studie verwendeten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Bezogen auf Autophagie

Coiled-Coil, Myosin-ähnliches BCL2-interagierendes Protein

Aus Eiern gewonnene Phosphatase

Fab 1 (Hefe-Orthologe von PIKfyve), YOTB, Vac 1 (Vesikeltransportprotein) und EEA1

Grün fluoreszierendes Protein

Insulinähnlicher Wachstumsfaktor

Mikrotubuli-assoziierte Proteine ​​1A/1B, leichte Kette 3B

Myotubularin

Myotubularin-bezogen

Phosphatidylinositol

Phosphatidylinositol-3-Kinase der Klasse III

Phosphatidylinositol-3-phosphat

Phosphatidylinositol-3,5-bisphosphat

Rubicon (RUN-Domäne und Cystein-reiche Domäne enthaltend, Beclin 1-interagierendes Protein)

Sequestosom 1

Ziel von Rapamycin

UV-Bestrahlungsresistenz-assoziiertes Gen

Vakuoläre Proteinsortierung 34

N6-Methyladenin

Kirkwood, TBL Ein systematischer Blick auf ein altes Problem. Natur 451, 644–647 (2008).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Vellai, T. Autophagie-Gene und Altern. Zelltod ist unterschiedlich. 16, 94–102 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Vellai, T., Takács-Vellai, K., Sass, M. & Klionsky, DJ Die Regulierung des Alterns: Liegt der Langlebigkeit Autophagie zugrunde? Trends Zellbiol. 19, 487–494 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Vellai, T. Wie die Aminosäure Leucin den wichtigen Zellwachstumsregulator mTOR aktiviert. Natur 596, 192–194 (2021).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Lopez-Otin, C., Blasco, MA, Partridge, L., Serrano, M. & Kroemer, G. Die Merkmale des Alterns. Zelle 153, 1194–1217.

Artikel Google Scholar

Sturm, Á., Ivics, Z. & Vellai, T. Der Mechanismus des Alterns: Primäre Rolle transponierbarer Elemente beim Genomzerfall. Zelle. Mol. Lebenswissenschaft. 72, 1839–1847 (2015).

Artikel CAS Google Scholar

Sturm, Á., Perczel, A., Ivics, Z. & Vellai, T. Der Piwi-piRNA-Weg: Weg zur Unsterblichkeit. Alternde Zelle 16, 906–911.

Artikel CAS Google Scholar

Takács-Vellai, K., Bayci, A. & Vellai, T. Autophagie beim Verlust neuronaler Zellen: ein Weg zum Tod. BioEssays 28, 1126–1131 (2006).

Artikel Google Scholar

Vellai, T., Tóth, ML & Kovács, AL Janusgesichtige Autophagie: Eine doppelte Rolle der zellulären Selbsternährung bei der Neurodegeneration?. Autophagie 3, 461–463 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Levine, B. & Kroemer, G. Autophagie in der Pathogenese von Krankheiten. Zelle 132, 27–42 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, AM & Klionsky, DJ Autophagie bekämpft Krankheiten durch zelluläre Selbstverdauung. Natur 451, 1069–1075 (2008).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Yang, Z. & Klionsky, DJ Lebendig gegessen: Eine Geschichte der Makroautophagie. Nat. Zellbiol. 12, 814–822 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Rubinsztein, DC Die Rolle intrazellulärer Proteinabbauwege bei der Neurodegeneration. Natur 443, 780–786 (2006).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Rubinsztein, DC, Mariño, G. & Kroemer, G. Autophagie und Altern. Zelle 146, 682–695 (2011).

Artikel CAS Google Scholar

Nezis, IP et al. Ref(2)P, das Drosophila melanogaster-Homolog von Säugetier-p62, ist für die Bildung von Proteinaggregaten im erwachsenen Gehirn erforderlich. J. Cell Biol. 180, 1065–1071 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Simonsen, A. et al. Die Förderung der Grundwerte der Autophagie im Nervensystem steigert die Langlebigkeit und Oxidationsresistenz bei erwachsenen Drosophila. Autophagie 4, 176–184 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Chang, JT, Kumsta, C., Hellman, AB, Adams, LM & Hansen, M. Raumzeitliche Regulierung der Autophagie während des Alterns von Caenorhabditis elegans. Elife 6, (2017).

Xie, Z., Nair, U. & Klionsky, DJ Atg8 steuert die Phagophorexpansion während der Autophagosomenbildung. Mol. Biol. Zelle 19, 3290–3298 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Nakamura, S. et al. Die Unterdrückung der autophagischen Aktivität durch Rubicon ist ein Zeichen des Alterns. Nat. Komm. 10, 1–11 (2019).

Artikel Google Scholar

Volinia, S. et al. Ein menschlicher Phosphatidylinolsitol-3-Kinase-Komplex, der mit dem Hefe-Vps34p-Vps15p-Proteinsortierungssystem verwandt ist. EMBO J. 14, 3339–3348 (1995).

Artikel CAS Google Scholar

Tosch, V. et al. Eine neuartige PtdIns3P- und PtdIns(3,5)P2-Phosphatase mit einer inaktivierenden Variante bei zentronukleärer Myopathie. Summen. Mol. Genet. 15, 3098–3106 (2006).

Artikel CAS Google Scholar

Vergne, I. et al. Kontrolle der Autophagie-Initiierung durch Phosphoinositid-3-Phosphatase-Jumpy. EMBO J. 28, 2244–2258 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Papp, D. et al. AUTEN-67, ein Autophagie-verstärkender Medikamentenkandidat mit starker Anti-Aging- und neuroprotektiver Wirkung. Autophagie 12, 273–286 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Erdélyi, P. et al. Gemeinsame Entwicklungsrollen und Transkriptionskontrolle von Autophagie und Apoptose bei Caenorhabditis elegans. J. Cell Sci. 124, 1510–1518 (2011).

Artikel Google Scholar

Manzéger, A. et al. Zustandsabhängige Funktionsverschiebung von zwei Drosophila-Mtmr-Lipidphosphatasen bei der Autophagiekontrolle. Autophagie https://doi.org/10.1080/15548627.2021.1899681 (2021).

Artikel Google Scholar

Petralia, RS et al. Sonic Hedgehog fördert die Autophagie in Neuronen des Hippocampus. Biol. Offen 2, 499–504 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Klionsky, DJ et al. Richtlinien für die Verwendung und Interpretation von Tests zur Überwachung der Autophagie (3. Auflage). Autophagie 12, 1–222 (2016).

Artikel Google Scholar

Walczak, M. & Martens, S. Untersuchung der Rolle des Atg12-Atg5-Atg16-Komplexes während der Autophagosomenbildung. Autophagie 9, 424–425 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Gillooly, DJ et al. Lokalisierung von Phosphatidylinositol-3-phosphat in Hefe- und Säugetierzellen. EMBO J. 19, 4577–4588 (2000).

Artikel CAS Google Scholar

Mizushima, N. et al. Analyse der Autophagosomenbildung mit Apg5-defizienten embryonalen Stammzellen der Maus. J. Cell Biol. 152, 657–668 (2001).

Artikel CAS Google Scholar

Billes, V. et al. Für die Augenbildung bei Drosophila ist eine entwicklungsregulierte Autophagie erforderlich. Autophagie 14, 1499–1519 (2018).

Artikel CAS Google Scholar

Bjørkøy, G. et al. p62/SQSTM1 bildet durch Autophagie abgebaute Proteinaggregate und hat eine schützende Wirkung auf den Huntingtin-induzierten Zelltod. J. Cell Biol. 171, 603–614 (2005).

Artikel Google Scholar

Sigmond, T. et al. Kapitel 30 Autophagie bei Caenorhabditis elegans. Methoden Enzymol. 451, 521–540 (2008).

Artikel CAS Google Scholar

Kovács, T. et al. Das kleine Molekül AUTEN-99 (Autophagie-Enhancer-99) verhindert das Fortschreiten neurodegenerativer Symptome. Wissenschaft. Rep. 7, 42014 (2017).

Artikel ADS Google Scholar

Billes, V. et al. AUTEN-67 (Autophagy Enhancer-67) hemmt das Fortschreiten neurodegenerativer Symptome in einem Drosophila-Modell der Huntington-Krankheit. J. Huntingtons. Dis. 5, 133–147 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Lőrincz, P., Mauvezin, C. & Juhász, G. Erforschung der Autophagie bei Drosophila. Zellen 6, 22 (2017).

Artikel Google Scholar

Mizushima, N. & Yoshimori, T. Wie man LC3-Immunoblotting interpretiert. Autophagie 3, 542–545 (2007).

Artikel CAS Google Scholar

Zou, J. et al. Die Rolle von Myotubularin-bezogenen Phosphatasen bei der Kontrolle von Autophagie und programmiertem Zelltod. Adv. Biol. Regul. 52, 282 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Jin, N. et al. Rollen von PI(3,5)P2 bei der Nährstofferkennung durch TORC1. Mol. Biol. Zelle 25, 1171 (2014).

Artikel Google Scholar

Chen, Z. et al. TORC1 bestimmt die Funktion der Fab1-Lipidkinase an signalgebenden Endosomen und Vakuolen. Curr. Biol. 31, 297-309.e8 (2021).

Artikel Google Scholar

Seroude, L., Brummel, T., Kapahi, P. & Benzer, S. Räumlich-zeitliche Analyse der Genexpression während des Alterns in Drosophila melanogaster. Aging Cell 1, 47–56 (2002).

Artikel CAS Google Scholar

Yao, B. et al. DNA-N6-Methyladenin wird im Gehirn von Mäusen infolge von Umweltstress dynamisch reguliert. Nat. Komm. 8, 1122 (2017).

Artikel ADS Google Scholar

Tóth, ML et al. Langlebigkeitspfade laufen auf Autophagie-Genen zusammen, um die Lebensspanne bei Caenorhabditis elegans zu regulieren. Autophagie 4, 330–338 (2008).

Artikel Google Scholar

Vellai, T. & Takács-Vellai, K. Regulierung des Proteinumsatzes durch Langlebigkeitspfade. Adv. Exp. Med. Biol. 694, 69–80 (2010).

Artikel CAS Google Scholar

Allen, EA et al. Eine konservierte Myotubularin-verwandte Phosphatase reguliert die Autophagie, indem sie den autophagischen Fluss aufrechterhält. J. Cell Biol. 219, (2020).

Chang, YY & Neufeld, TP Ein Atg1/Atg13-Komplex mit mehreren Rollen bei der TOR-vermittelten Autophagie-Regulation. Mol. Biol. Zelle 20, 2004–2014 (2009).

Artikel CAS Google Scholar

Denton, D., Nicolson, S. & Kumar, S. Zelltod durch Autophagie: Fakten und offensichtliche Artefakte. Zelltod ist unterschiedlich. 19, 87–95 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Pircs, K. et al. Vorteile und Grenzen verschiedener p62-basierter Tests zur Abschätzung der autophagischen Aktivität bei Drosophila. PLoS ONE 7, e44214 (2012).

Artikel ADS CAS Google Scholar

Kis, V., Barti, B., Lippai, M. & Sass, M. Spezialisierte Cortex-Gliazellen sammeln Lipidtröpfchen in Drosophila melanogaster. PLoS One https://doi.org/10.1371/journal.pone.0131250.PDF (2015).

Artikel Google Scholar

Takáts, S. et al. Der autophagosomale Syntaxin17-abhängige lysosomale Abbau erhält die neuronale Funktion in Drosophila aufrecht. J. Cell Biol. 201, 531–539 (2013).

Artikel Google Scholar

Szabo, M. & Gulya, K. Entwicklung des Mikroglia-Phänotyps in Kultur. Neurowissenschaften 241, 280–295 (2013).

Artikel CAS Google Scholar

Tóth, K. et al. Verlust und Reorganisation von Calretinin-haltigen Interneuronen im epileptischen menschlichen Hippocampus. Gehirn 133, 2763–2777 (2010).

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Diese Arbeit wurde durch die OTKA-Zuschüsse (Ungarischer Wissenschaftlicher Forschungsfonds) K109349 und K132439 an TV, das MEDInPROT Protein Science Research Synergy Program (bereitgestellt von der Ungarischen Akademie der Wissenschaften; HAS) an TV, die Europäische Union und den Staat Ungarn unterstützt -finanziert durch den European Regional Development Found (VEKOP-2.3.2-16-2017-00014) an TV, GINOP 2.3.2-15-2016-00034 an KG, ERC Starting (680040) und Bolyai (HAS) an EK. und National Brain Research Program (2017-1.2.1-NKP-2017-00002) an ZM. Die Studie wurde von der Ungarischen Akademie der Wissenschaften durch ein Stipendium an die MTA-ELTE „Lendület/Momentum“ Companion Animal Research Group (Stipendium Nr. PH1404/21) und das National Brain Program 3.0 (NAP2022-I-3/2022) unterstützt. zu EK. VB und TV wurden von der ELKH-ELTE Genetics Research Group (01062) unterstützt. Diese Arbeit wurde im Rahmen des ELTE Institutional Excellence Program abgeschlossen, das vom National Research, Development and Innovation Office (NKFIH-1157-8/2019-DT) unterstützt wird. MP wurde vom Ungarischen Hirnforschungsprogramm (2017-1.2.1. NKP-2017-00002) unterstützt. Menschliches Gewebe wurde teilweise vom Saint Borbala Hospital, Tatabánya, Ungarn, und dem Laboratory of Human Brain Research, Institute of Experimental Medicine, HAS, Budapest, Ungarn, bereitgestellt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Tibor Kovács und Janka Szinyákovics.

Abteilung für Genetik, ELTE Eötvös Loránd Universität, Péter Pázmány Stny. 1/C, Budapest, 1117, Ungarn

Tibor Kovács, Janka Szinyakovics, Viktor Billes, Gábor Murányi, Virginia B. Varga und Tibor Vellai

MTA-ELTE Genetics Research Group, Budapest, 1117, Ungarn

Viktor Billes & Tibor Vellai

Abteilung für Zellbiologie und Molekulare Medizin, Universität Szeged, Szeged, 6720, Ungarn

Annamária Bjelik, Ádám Légrádi, Melinda Szabó und Károly Gulya

Abteilung für Ethologie, ELTE Eötvös Loránd Universität, Budapest, 1117, Ungarn

Sándor Sára & Enikő Kubinyi

Human Brain Research Laboratory, Institut für Experimentelle Medizin, ELKH, Budapest, 1085, Ungarn

Cecília Szekeres-Paracky, Péter Szocsics und Zsófia Maglóczky

János Szentágothai Doctoral School of Neuroscience, Semmelweis-Universität, Budapest, 1085, Ungarn

Cecília Szekeres-Paracky & Péter Szocsics

Abteilung für Psychiatrie, St. Borbala-Krankenhaus, Tatabánya, 2800, Ungarn

János Löke

Science for Life Laboratory, Abteilung für Neurowissenschaften, Karolinska-Institut, 171 77, Stockholm, Schweden

Jun Mulder

Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, Singapur, 636921, Singapur

Balázs Gulyás

Bank und Labor für menschliches Gehirngewebe, Semmelweis-Universität, Budapest, 1085, Ungarn

Éva Renner & Miklós Palkovits

MTA-ELTE Lendület „Momentum“ Companion Animal Research Group, Budapest, Ungarn

Eniko Kubinyi

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TK entwarf und führte Experimente mit Drosophila und menschlichen Proben durch, analysierte Daten und verfasste das Manuskript; JS führte Experimente an Drosophila- und menschlichen Proben durch und analysierte Daten; VB führte verschiedene Experimente an Drosophila durch, GM war an der Analyse der EDTP-Expression beteiligt; VBV führte Experimente an Drosophila durch; AB, Á.L. und MS führte die Expressionsanalyse von p62 und MTMR14 in menschlichen Gehirnproben durch; SS führte die Expressionsanalyse von MTMR14 in Gehirnproben von Hunden durch; CS-P. und PS führte die Quantifizierung der MTMR-Akkumulationsniveaus in menschlichen Gehirnproben durch; JL stellte menschliche Gehirngewebeproben zur Verfügung und analysierte sie; MP und ER führten eine Mikrodissektion menschlicher Hirnrindenbereiche durch; JM führte die Analyse der p62-Akkumulation in postmortalen menschlichen Gehirnproben durch; EK, BG, KG, ZM und TV entwarfen Experimente, analysierten Daten und verfassten das Manuskript.

Korrespondenz mit Károly Gulya, Zsófia Maglóczky oder Tibor Vellai.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Kovács, T., Szinyákovics, J., Billes, V. et al. Eine konservierte MTMR-Lipidphosphatase unterdrückt im Alter zunehmend die Autophagie in Gehirnneuronen. Sci Rep 12, 21817 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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Eingegangen: 01. Dezember 2021

Angenommen: 21. November 2022

Veröffentlicht: 17. Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24843-w

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