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Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 16579 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Baumwollratte (Sigmodon) ist das präklinische Kleintiermodell des Goldstandards für respiratorische Viruspathogene, insbesondere für das Respiratory Syncytial Virus (RSV). Ohne ein Referenzgenom oder ein veröffentlichtes Transkriptom sind Studien, die eine Genexpressionsanalyse bei Baumwollratten erfordern, jedoch stark eingeschränkt. Das Ziel dieser Studie bestand darin, ein umfassendes Transkriptom aus mehreren Geweben von zwei Arten von Baumwollratten zu erstellen, die häufig als Tiermodelle verwendet werden (Sigmodon fulviventer und Sigmodon hispidus), und Genexpressionsänderungen und Immunantworten auf eine RSV-Infektion zwischen ihnen zu vergleichen und gegenüberzustellen die beiden Arten. Für jede Art mit einem Contig N50 > 1600 wurden Transkriptome aus Lunge, Milz, Niere, Herz und Darm zusammengestellt. Die Annotation von Contigs erzeugte fast 120.000 Genannotationen für jede Art. Die Transkriptome von S. fulviventer und S. hispidus wurden dann zur Beurteilung der Immunantwort auf eine RSV-Infektion verwendet. Wir haben 238 einzigartige Gene identifiziert, die signifikant unterschiedlich exprimiert werden, darunter mehrere Gene, die an einer RSV-Infektion beteiligt sind (z. B. Mx2, I27L2, LY6E, Viperin, Keratin 6A, ISG15, CXCL10, CXCL11, IRF9) sowie neue Gene, die zuvor nicht beschrieben wurden in der RSV-Forschung (LG3BP, SYWC, ABEC1, IIGP1, CREB1). Diese Studie präsentiert zwei umfassende Transkriptom-Referenzen als Ressourcen für zukünftige Studien zur Genexpressionsanalyse im Baumwollrattenmodell und liefert Gensequenzen für die mechanistische Charakterisierung molekularer Signalwege. Insgesamt liefern unsere Ergebnisse verallgemeinerbare Einblicke in die Wirkung der Wirtsgenetik auf Wirt-Virus-Interaktionen und identifizieren neue therapeutische Wirtsziele für die RSV-Behandlung und -Prävention.

Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist die häufigste Ursache für Infektionen der unteren Atemwege (LRTI) bei Kindern unter zwei Jahren sowie bei immungeschwächten Personen und älteren Menschen und führt zu 33 Millionen LRTIs, 3,2 Millionen Krankenhauseinweisungen und fast 100.000 Patienten 120.000 Todesfälle weltweit jedes Jahr1. Derzeit gibt es keinen zugelassenen RSV-Impfstoff und nur einen präventiven monoklonalen Antikörper (Palivizumab), wobei der Einsatz aus Kostengründen auf Hochrisikokinder beschränkt ist2,3. Da 93 % der RSV-LRTI-Fälle und 99 % der RSV-Mortalität in Entwicklungsländern auftreten, ist der Bedarf an einem wirksamen Impfstoff und kostengünstigen Präventivmaßnahmen von entscheidender Bedeutung1. Das Scheitern des formalininaktivierten RSV-Impfstoffs in den 1960er Jahren, der bei der Begegnung mit dem Virus bei den Geimpften eine verstärkte Erkrankung auslöste, behinderte die Entwicklung neuer RSV-Impfstoffe jahrzehntelang4–6. Allerdings gibt es in jüngster Zeit erneut Anstrengungen zur Entwicklung von RSV-Präventionsmitteln, wobei sich 14 Impfstoffkandidaten und alternative antivirale Strategien gegen RSV (rekombinante Antikörper7, Nanokörper8, niedermolekulare Inhibitoren und Analoga9) in verschiedenen Entwicklungsstadien befinden10. Dies unterstreicht den dringenden Bedarf an einem geeigneten präklinischen Modell für die Impfstoff- und Arzneimittelentwicklung gegen RSV.

Die Baumwollratte (Gattung Sigmodon) gilt im Vergleich zu Mäusen und anderen Tieren als „Goldstandard“-Tiermodell für eine RSV-Infektion, da sie gegenüber einer RSV-Infektion 100-mal toleranter ist als die meisten Labormäuse und RSV sowohl die obere als auch die untere Seite infiziert Atemwege ähnlich wie beim Menschen11–13. Baumwollratten haben auch die Wirksamkeit der beiden von der FDA zugelassenen RSV-Therapeutika (RespiGam®, Palivizumab®) genau vorhergesagt14–17. Zusätzlich zu RSV wurden Baumwollratten aufgrund der breiten Anfälligkeit auch zur Untersuchung anderer bedeutender menschlicher Atemwegsviren eingesetzt, z vergleichbare menschliche Krankheitsmerkmale26. Leider waren Studien zum Vergleich transkriptomischer Veränderungen bei Baumwollratten begrenzt, da es für keine Baumwollrattenart ein öffentlich verfügbares Referenzgenom gab. Zuvor haben wir ein durch RSV induziertes Lungengewebe-Transkriptom in S. hispidus veröffentlicht27. Allerdings hatten wir in dieser Studie nur die Expression in einem Gewebetyp analysiert und sie war auf nur eine Baumwollrattenart (S. hispidus) beschränkt. Wie frühere Studien zeigen, unterscheiden sich sowohl S. fulviventer- als auch S. hispidus-spezifische Krankheitsschwere gegenüber viralen Krankheitserregern (z. B. Parainfluenzavirus28, HIV29) und der Struktur der Mikrobiomgemeinschaft30. Die Hauptziele dieser Studie bestanden darin, umfassende Transkriptome für beide Arten zu entwickeln und Genexpressionsänderungen bei einer RSV-Infektion zu vergleichen und gegenüberzustellen.

Zu diesem Zweck sequenzierten wir die Gesamt-RNA mehrerer Gewebe (Lunge, Milz, Herz, Niere, Dickdarm) von gesunden Tieren und erstellten ein umfassendes Transkriptom mithilfe der De-novo-Assemblierung mit funktioneller Annotation für zwei Arten von Baumwollratten (S. fulviventer und S. hispidus). Anschließend infizierten wir neben nicht infizierten Kontrollen jede Baumwollrattenart mit dem RSV A/Long-Stamm und verwendeten unsere Transkriptomreferenzen, um nach einer RSV-Infektion unterschiedlich exprimierte Gene zu bestimmen.

Die Gesamt-RNA wurde aus Abschnitten von Milz, Herz, Niere, Lunge und Dickdarm extrahiert, die von 4–6 Wochen alten gesunden S. fulviventer und S. hispidus entnommen wurden, um eine umfassende Transkriptomassemblierung zu ermöglichen (Ergänzungstabelle 1). Die RNA-seq-Bibliotheken wurden bis zu einer Tiefe von 50 Millionen Paired-Ends 2 × 150 pro Probe sequenziert. Nach der Sequenzierung der Read-QC haben wir Daten aus allen gesunden Geweben (n = 2 pro Art, Lunge n = 4 pro Art) gepoolt, um 456 Millionen Paired-End-Reads für S. fulviventer (GC-Gehalt 54,9 %) und 465 Millionen Paired-End-Reads zu generieren für S. hispidus (GC-Gehalt 53,1 %). Das Transkriptom für jede Art wurde mithilfe einer De-novo-Assemblierung erstellt, die dann als Referenzdatenbank zur Bewertung von RSV-induzierten transkriptomischen Veränderungen in der Lunge der infizierten Tiere im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen verwendet wurde.

Für jede Art wurden sequenzierte Messungen aller fünf Gewebetypen kombiniert. Trinity31 wurde für die De-novo-Zusammenstellung von Contigs (auch als „Transkripte“ bezeichnet) nach In-silico-Normalisierung verwendet, um eine durchschnittliche Abdeckung von 50x zu erreichen. Der Assembler generierte über 1,3 Millionen Contigs pro Art, die basierend auf Länge32 und Redundanz33,34 weiter gefiltert wurden (Ergänzungstabelle 1). Die folgenden Zusammenstellungsstatistiken sind in Tabelle 1 aufgeführt. Jedem Transkript wurde eine eindeutige Kennung zugewiesen, die jedes „Gen“ (S. fulviventer = 587.619, S. hispidus = 559.830) und ihre alternativ gespleißten „Isoformen“ (S. fulviventer = 620.569, S. hispidus = 592.099). Zusammengesetzte Transkripte beider Arten hatten einen GC-Gehalt von 43 % und einen Contig-N50-Wert von > 1600 (was den N50-Wert anderer veröffentlichter Transkriptom-Assemblies übersteigt35,36,37). Der Ex90N50, der der N50 ist, aber auf die oberen 90 % der gesamten normalisierten Transkripte beschränkt ist, betrug 2503 (S. fulviventer, #transcripts = 108.995) und 2162 (S. hispidus, #transcripts = 240.587) (Tabelle 1).

Die Anzahl der Transkripte und ihre Expressionsniveaus variierten je nach Gewebetyp, und mehrere Transkripte waren gewebespezifisch, wobei die Lunge die größte Anzahl einzigartiger Transkripte aufwies (S. fulviventer = 47.448, S. hispidus = 38.270) (Abb. 1A, B ). Andere Transkripte wurden entweder in allen 5 Geweben (S. fulviventer = 216.307, S. hispidus = 225.833) oder in einer Kombination aus zwei oder mehr Gewebetypen gefunden (Abb. 1A, B). Viele Transkripte wurden zwischen Geweben unterschiedlich exprimiert (S. fulviventer = 49.215, S. hispidus = 55.415), wie durch DESeq2 bestimmt und durch hierarchisches Heatmap-Clustering38 visualisiert (Abb. 1C, D). Die Hauptkomponentenanalyse zeigt signifikante Unterschiede in den Genexpressionsmustern zwischen Arten und verschiedenen Gewebeproben, was durch eine starke Häufung je nach Art und Gewebetyp angezeigt wird (Abb. 1E). Nach der Zusammenstellung wurden die Transkripte mithilfe der Proteinsequenzdatenbank (SwissProt) mit Anmerkungen versehen, um nach Homologie mit anderen Spezies zu suchen. Bei beiden Arten hatten die Transkripte die höchste Homologie mit Mus musculus (54 %), Homo sapiens (17 %) und Rattus rattus (13 %) (Abb. 1F).

Zusammenbau des Sigmodon-Transkriptoms mit Trinity. (A,B) UpSet-Diagramm überlappender und gewebespezifischer Transkripte, die in der Milz (blau), dem Herzen (grün), der Niere (rot), dem Dickdarm (orange) und der Lunge (blau) von beiden (A) S. fulviventer exprimiert werden (n = 2) und (B) S. hispidus (n = 2). Balken für überlappende Sequenzen werden in Schwarz angezeigt, während Balken für Sequenzen, die für einzelne Organe spezifisch sind, in entsprechenden Farben angezeigt werden. Die Anzahl der überlappenden Transkripte wird über jedem Balken angezeigt, mit einem Vergleich der einzelnen Organe auf der Y-Achse. Die Anzahl der einzigartigen Gene pro Gewebe wird durch das horizontale Balkendiagramm dargestellt. (C,D) Hierarchische Clusterbildung und Heatmap nach Z-Score aller unterschiedlich exprimierten Transkripte (Q < 0,001,L2fc > 2, euklidischer Abstand) innerhalb einzelner Gewebeproben von (C) S. fulviventer und (D) S. hispidus. (E) Hauptkomponentenanalyse (PCA) exprimierter Transkripte in gesundem Gewebe beider Arten. (F) Taxonomische Quelle der Genanmerkungen, bestimmt durch NCBI BlastX. Die Daten stellen Anmerkungen zum Transkriptom von S. fulviventer dar; S. hispidus wird nicht angezeigt, variiert aber in allen Kategorien außer „Sonstige“ um ~ 1 %.

Um die Qualität unserer Assemblierung zu bewerten (Tabelle 1), haben wir die gesamte Assemblierung mithilfe von Bowtie239 wieder den qualitätsreduzierten Lesevorgängen zugeordnet und dabei festgestellt, dass 81,9 % bzw. 87,9 % der Lesevorgänge während der Zusammenstellung des S. fulviventer- bzw. S. hispidus-Transkriptoms verwendet wurden , wobei > 70 % auf eine gute Qualität schließen lassen. Wir haben auch die Vollständigkeit des Transkriptoms bewertet, indem wir in unserem Datensatz nach evolutionär konservierten BUSCO40-Gruppen aus dem Abstammungsdatensatz vertebrata_odb10 (insgesamt n = 3354) gesucht haben. Die S. fulviventer-Ansammlung hatte 92,7 % vollständige BUSCOs (vollständig: 3109 [vollständig und einzeln: 785, vollständig und dupliziert: 2324], fragmentiert: 154, fehlt: 91), und S. hispidus hatte 90,2 % vollständige BUSCOs (vollständig: 3025 [vollständig und einzeln: 2599). , vollständig und dupliziert: 426], fragmentiert: 194, fehlt: 135). Alle Statistiken zur Assemblierungsqualität sind auch in Tabelle 1 aufgeführt. Die endgültigen Referenz-Transkriptom-Assemblys für jede Art werden als Zusatzdatei 1 (S. hispidus) und Zusatzdatei 2 (S. fulviventer) zur Verfügung gestellt.

Transkripte wurden mithilfe der Trinotate-Pipeline (https://trinotate.github.io/) funktional mit Anmerkungen versehen. Transkriptomreferenzen wurden für jede Art unabhängig generiert. Zunächst wurden Baumwollratten-Transkripte auf der Grundlage der Sequenzhomologie mit einer nicht-redundanten Protein-Annotationsdatenbank (UniProt41) abgeglichen, die Sequenzen aus 14.132 verschiedenen Taxa (http://web.expasy.org/docs/relnotes/relstat.html) enthält über BLASTx42 (Cutoff-E-Wert < 1e-05). Wir haben 118.060 Transkripte mit 18.726 einzigartigen Genen für S. fulviventer und 117.153 Transkripte mit 18.380 einzigartigen Genen für S. hispidus aus den ca. 600.000 für jede Art zusammengestellten Transkripten kommentiert (Tabelle 1). Anschließend wurden die kodierenden Regionen anhand offener Leserahmen identifiziert (S. fulviventer = 118.159, S. hispidus = 113.999). Proteinkodierende Transkripte wurden mit BLASTp42 (Cutoff-E-Wert < 1e05) anhand der UniProt-Datenbank41 annotiert, um > 30.000 annotierte Proteine ​​pro Spezies zu identifizieren (~ 17.000 Proteine ​​nach dem Filtern doppelter Annotationen). Proteine ​​wurden anhand von Proteindomänen (> 5.000), Transmembranhelices (> 18.000) und Signalproteinen (> 7.700) weiter annotiert. Alle Anmerkungsstatistiken finden Sie in Tabelle 1, und der vollständige Anmerkungsbericht kann in der Zusatzdatei 3 eingesehen werden.

Zusätzlich zu den Annotationen von Gennamen wurden im BLAST-Alignment an UniProt auch mehrere funktionale Begriffe zur Beschreibung von Genen zugewiesen, darunter Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) Pathways43, Gene Ontology (GO)44 und EggNOG-Orthologie45. Die Begriffe der Genontologie (GO) beschreiben die funktionellen Eigenschaften von Genen und ihre Beziehung zueinander. Ein oder mehrere GO-Begriffe wurden 98,35 % der mit S. fulviventer annotierten Transkripte (n = 116.115) und 98,45 % der mit S. hispidus annotierten Transkripte (n = 115.332) zugewiesen. GO-Begriffe wurden in drei Kategorien eingeteilt: Biologische Prozesse, Zellkomponenten und Molekulare Funktion (Abb. 2). Gene von S. fulviventer und S. hispidus wiesen ein ähnliches Verhältnis assoziierter GOs auf. Zu den wichtigsten GOs für biologische Prozesse gehörten „Stoffwechselprozesse von zellulären Stickstoffverbindungen“ (~ 25 %), „DNA-Stoffwechselprozesse“ (~ 17 %), „Transport“ (~ 16 %) und „Entwicklung anatomischer Strukturen“ (~ 15 %). (Abb. 2A). Zelluläre Komponenten-GOs bestanden hauptsächlich aus „Organellen“ (~ 38 %), „Zytoplasma“ (~ 24 %), „Zytosol“ (~ 18 %) und „Kern“ (16 %) (Abb. 2B). Zu den häufigsten molekularen Funktions-GOs gehören „Nukleotidyltransferase“ (~ 15 %), „Nuklease“ (~ 15 %), „Enzymbindung“ (~ 9 %) und „Nukleinsäurebindung“ (RNA = 8 %, DNA = 8). %) (Abb. 2C).

Annotation des Sigmodon-Transkriptoms. (A) Biologische Prozesse, (B) zelluläre Komponenten und (C) molekulare Funktion SwissProt Gene Ontology (GO)-Begriffe auf der x-Achse (Gesamt-GOs innerhalb der jeweiligen Kategorien, einschließlich der in den Abbildungslegenden dargestellten Überlappungen) mit der Anzahl der GOs (Prozentsatz von insgesamt ~ 107.000 kommentierte Transkripte) auf der y-Achse; GOs wurden anhand der TrEMBL/SwissProt-Datenbank mit Trinotate v.3.2.2 zugewiesen. (D) Die 25 wichtigsten KEGG- und (E) immunsystemspezifischen Signalwege auf der x-Achse mit der Gesamtzahl der proteinkodierenden Gene auf der y-Achse; Pfade, die mithilfe von TransDecoder-bestimmtem CDS zugewiesen wurden, gefolgt von GhostKOALA (https://www.kegg.jp/ghostkoala/).

Die Mehrzahl der identifizierten KEGG-Signalwege gehörten zum Stoffwechsel und zur Signalübertragung, insbesondere zur Sekundärmetabolitenbiosynthese, zu Liganden-/Zytokin-/Metallrezeptor-Wechselwirkungen und zu einer Vielzahl von Signalwegen (Abb. 2D, siehe auch Abbildung S1A für die Verteilung von „Signalisierung und Membrantransport“ KEGG). Wege). Wir untersuchten immunspezifische KEGG-Signalwege, um die große Anzahl relevanter Gene aufzuzeigen, die im De-novo-Transkriptom identifiziert wurden, darunter Chemokin-Signalisierung, angeborene und adaptive Zellrezeptor-Signalisierung, Komplementkaskaden und Lymphozytendifferenzierung (Abb. 2E). KEGG bietet auch eine Genkartierung für viele Infektionswege, einschließlich erfolgreich in Baumwollratten modellierter Infektionserreger, z. B. Influenza18, HIV-129 und Masern22 (Abbildung S1B). Wir haben Genanmerkungen von S. fulviventer und S. hispidus den Wirtsgenen zugeordnet, die mit dem KEGG-Signalweg einer Influenza-Infektion assoziiert sind, der 94,3 % der während einer Influenza-Infektion erforderlichen Gene umfasste (Abb. 3). Alle anderen Pfade können mit dem Rekonstruktionstool von KEGG (https://www.kegg.jp/kegg/mapper/reconstruct.html) unter Verwendung der in der Zusatzdatei 4 enthaltenen Daten rekonstruiert und visualisiert werden.

Der Influenza Disease Pathway (angepasst aus der Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes [KEGG]). 99 der 105 essentiellen Gene der Influenza-Pathogenese wurden erfolgreich in unserem De-novo-Transkriptom von S. fulviventer und S. hispidus zusammengestellt und annotiert. Erstellt mit BioRender.

Wir haben S. fulviventer und S. hispidus intranasal mit 105 PFU RSV A/Long oder PBS (als Scheininfektionskontrolle) infiziert und 5 Tage nach der Infektion Lungen zur Analyse entnommen. Die Infektion wurde durch qRT-PCR bestätigt, die auf die RSV G- und F-mRNA abzielte, wobei bei infizierten Tieren eine signifikant höhere RNA-Kopie gefunden wurde, während bei nicht infizierten Kontrollen keine Amplifikation viraler RNAs auftrat (Abb. 4A). Es gab keinen signifikanten Unterschied in den viralen RNA-Spiegeln zwischen S. fulviventer und S. hispidus nach einer 5-tägigen Infektion (p = 0,3491, Tukeys Mehrfachvergleichstest). Lungengewebe wurde auf Histopathologie untersucht (Abb. 4B) und blind auf 4 Entzündungsparameter hin bewertet, wie in den Methoden beschrieben: Peribronchiolitis, Perivaskulitis, interstitielle Pneumonie und Alveolitis (Abb. 4C). Jedes infizierte Tier hatte im Vergleich zu nicht infizierten Kontrollen einen deutlich höheren kumulativen Pathologiewert, was auf eine erfolgreiche Infektion hinweist (Sf p = 0,0020, Sh p = < 0,0001, Tukeys Mehrfachvergleichstest) (Abb. 4C). Anschließend wurde die RNA wie beschrieben sequenziert und die Lesevorgänge für jede Art mit dem zuvor annotierten Referenztranskriptom abgeglichen. Nach der Normalisierung der Expression zeigte die Genexpressionsanalyse, dass die RSV-Infektion die Expressionsmuster signifikant veränderte. Eine RSV-Infektion in der Lunge von S. hispidus führte zu stärkeren Veränderungen der Genexpression als bei S. fulviventer (ergänzende Abbildung 2).

RSV-induzierte Veränderungen der Lungenumgebung. (A) Virustiter (RSV-G- und -F-Proteine) in nicht infizierten und infizierten Lungen, bestimmt durch qRT-PCR, normalisiert auf β-Actin; Faltungsänderung (berechnet durch 2−ΔΔCT) auf der y-Achse. (B) Histopathologische Bildgebung und (C) blind generierte Pathologiebewertung sowohl für gesundes (n = 4/Art) als auch RSV-infiziertes (n = 5/Art) Lungengewebe von S. fulviventer und S. hispidus. (D,E) Die DESeq2-Analyse zusammengesetzter Gene aus Lungengewebe (dasselbe Gewebe ist in den Abbildungen AB abgebildet) ergab mehrere Gene, die zwischen gesunden und infizierten Geweben unterschiedlich exprimiert werden (DE) (p < 0,05, q < 0,05, l2fc >|1,0|). ) von S. fulviventer (blau) und S. hispidus (rot), von denen mehrere Gene erfolgreich mit Trinotate annotiert wurden (wie in den Kästchen angegeben). *p ≤ 0,05, **p ≤ 0,01, ***p ≤ 0,001, ****p ≤ 0,0001.

Analysen der differenziellen Genexpression (RSV A/Long vs. scheininfizierte Kontrollen) identifizierten mehrere Gene, die in infizierten Lungen unterschiedlich hoch- und herunterreguliert wurden, einschließlich Genen, die für jede Baumwollrattenart einzigartig und gemeinsam sind (Abb. 4D). Eine RSV-Infektion in S. fulviventer führte zu 325 einzigartigen hochregulierten Genen (98 annotierte) und 140 einzigartigen herunterregulierten Genen (20 annotierte). Eine RSV-Infektion in S. hispidus führte zu 750 hochregulierten Genen (44 mit Anmerkungen) und 245 herunterregulierten Genen (8 mit Anmerkungen) (Abb. 4D, E, vollständige Daten in der Zusatzdatei 5). Durch die Kombination der Infektionsdaten beider Arten stellten wir fest, dass 276 Gene (12 annotierte) in beiden Arten hochreguliert waren, während 9 Gene (0 annotierte) in beiden Arten herunterreguliert waren. Für die weitere Analyse wurden nur annotierte Gene für jede Art ausgewählt. Zwanzig der am häufigsten differenziell exprimierten annotierten Gene (ausgewählt nach Funktion und Genontologie) sind in Tabelle 2 (S. fulviventer) und Tabelle 3 (S. hispidus) aufgeführt.

Bei S. fulviventer wurden bei einer Infektion mehrere Gene im Zusammenhang mit der Immunglobulinstruktur (HVM44), den Transkriptionsfaktoren (CREB1, CRY1), der Integrität der Epithelstruktur (K2C8), der Bildung und Aufrechterhaltung enger Verbindungen (OCLD) und der Regulierung des Membrantransports (CPNE3) herunterreguliert. , gezielter RNA-Abbau (MOV10) und Gewebeumbau und Homöostase (MFGM). GLYC, das RSV-G-Protein, wurde in RSV-Lungen als hochreguliert markiert, da in der nicht infizierten Gruppe keine Messwerte vorlagen (angezeigt durch DESeq2-Basismittelwert = 0). Hochregulierte Wirtsgene standen im Zusammenhang mit dem Komplementsystem (CFAB), der Immunrezeptorsignalisierung (UN93B), dem Vesikelhandel (EXOC5), der Interferon-induzierten antiviralen Aktivität (MX2, CXCL10, I27L2, OAS1A, IIGP1, ISG15) und dem Prostaglandinstoffwechsel (PGDH). und Elektronentransport (COX1). Diese unterschiedlich exprimierten S. fulviventer-Gene nach einer RSV-Infektion sind in Tabelle 2 aufgeführt.

In S. hispidus wurde nur ein annotiertes Gen herunterreguliert: LMTD1, das an der Zellproliferation beteiligt ist. Andere herunterregulierte Gene hatten Anmerkungen, die auf den Einschluss von Signalpeptiden (über SignalP) und Transmembranregionen (über TmHMM) hinwiesen, jedoch mit unbekannter Funktion (Ergänzungsdatei 5). Mehrere hochregulierte Immungene in S. hispidus waren auch in S. fulviventer hochreguliert (I27L2, CXCL10, MX2). Die meisten hochregulierten Gene standen im Zusammenhang mit der Zytokinstimulation der antiviralen Aktivität (OAS3, CXCL11, IRF9, IFIT1, NLRC5), dem proteasomalen Abbau (PSB9), der Reorganisation des Zytoskeletts als Reaktion auf Stress (SYWC, K2C6A), der T-Zell-Aktivierung (HSH2D, LY6E). posttranskriptionelle Regulation (ABEC1), viraler Proteinabbau (RSAD2/Viperin), Komplementweg (CO4A, C4BPA), chemischer Metabolismus (GBP4) und zelluläre abwehrbezogene Signaltransduktion (LG3BP). Diese unterschiedlich exprimierten S. hispidus-Gene nach einer RSV-Infektion sind in Tabelle 3 dargestellt.

Von den differentiell exprimierten Genen (DEGs) nach einer RSV-Infektion wurde festgestellt, dass 12 DEGs sowohl in S. fulviventer als auch in S. hispidus entweder hoch- oder herunterreguliert waren. Die Chemokine CXCL10, MX2 und I27L2 gehörten bei beiden Arten zu den Top 10 der hochregulierten Gene. Weitere DEGs innerhalb unserer Signifikanzschwelle sind GBP2, GBP4, IRF9, NLRC5, OAS3, PAR14, RN213, SYWC und IIGP1. Alle DEs finden Sie in der Zusatzdatei 5.

Darüber hinaus wurden differenziell ausgedrückte Gene Ontology (GO)-Begriffe mithilfe des GoSeq R-Pakets46 bestimmt. Die wichtigsten GOs, die in infizierten Lungen von S. fulviventer (Abb. 5A) und S. hispidus (Abb. 5B) angereichert wurden, waren „biologische Prozesse“ wie die Reaktion auf Zytokine und Interferon-beta, Prozesse des Immunsystems und Signalwege für Zelloberflächenrezeptoren und viraler Prozess; „molekulare Funktionen“ wie Ionenbindung, katalytische Aktivität, Hydrolaseaktivität und „zelluläre Komponenten“ wie intrazelluläre membranumgrenzte Organellen und Kerne. Andere angereicherte GOs in infizierten Lungen standen im Zusammenhang mit der Verbesserung der Komponenten und Funktionen von Zellen, wie z. B. Komponenten der Membran und Vesikel, der Reaktion auf Stress, der Regulierung apoptotischer Prozesse, der Regulierung der viralen Genomreplikation, der Leukozytenaktivierung und der Bindung von Kohlenhydraten und anderen organische Verbindungen. Nur S. hispidus wies in gesundem Gewebe angereicherte GOs auf, und dazu gehörte auch die zelluläre Komponente, die am Komplex des Guanyl-Nukleotid-Austauschfaktors beteiligt ist.

Kategorische Veränderungen der Genexpression nach RSV-Infektion sowohl bei (A) S. fulviventer als auch (B) S. hispidus unter Verwendung von Gene Ontology (GO)-Annotationen und GoSeq. SwissProt GO-Terme auf der y-Achse (farbkoordiniert basierend auf biologischem Prozess [blau], Zellkomponente [grün] oder molekularer Funktion [rot]) mit relativer Expression von GOs auf der x-Achse (ausgedrückt als GeneRatio, d. h Anteil der differentiell exprimierten Gene in jeder GO-Kategorie an der Gesamtzahl der differentiell exprimierten Gene in allen signifikanten GOs. Positives GeneRatio = angereichert in RSV-infizierten Lungen; negatives GeneRatio = angereichert in gesunden Lungen (keine signifikanten GOs in gesundem S. fulviventer). Alle GOs waren statistisch signifikant (p < 0,05, q < 0,05).

Zur Bestätigung der DEGs wurden drei de novo zusammengesetzte Gene basierend auf ihrer Hochregulierung am Tag 5 nach der Infektion ausgewählt (Shisp_DN132151_c0_g1 [IIGP1], Shisp_DN12103_c7_g1 [I27L2], Sfulv_DN158_c1_g1 [IIGP1]). qRT-PCR mit SYBR Green wurde mit Primern durchgeführt, die auf jedes Gen abzielten und auf das β-Actin-Housekeeping-Gen normalisiert waren. Zu den drei Genen gehörten IIGP1 sowohl in S. fulviventer als auch S. hispidus und I27L2 in S. hispidus. qRT-PCR bestätigte eine Hochregulierung des Gens nach einer RSV-Infektion (d. h. positive Fold Changes), die mit den RNA-Seq-Daten korrelierte (Ergänzungstabelle 2).

Um die veröffentlichte differenzielle Expressionsanalyse von Rajagopala et al.27, bei der S. hispidus in derselben Einrichtung mit demselben Virusstamm und derselben Viruskonzentration mit RSV A/Long infiziert wurde, weiter zu bestätigen und zu validieren, haben wir außerdem einen Vergleich mit in dieser Studie identifizierten DEGs durchgeführt allerdings wurden die Proben an verschiedenen Tagen entnommen. Die Studie von Rajagopala et al.27 umfasste zwei Zeitpunkte; Tag 4 und 6 nach der Infektion, während wir in dieser Studie nur am Tag 5 Proben entnommen haben. Die in beiden Studien verwendeten DESeq2-Analyseparameter sind jedoch dieselben. Im Vergleich zu Rajagopala et al.27 bestätigte diese aktuelle Studie 4 der 5 eukaryotischen DEGs (IFIT1, MX2, OASL2, RSAD2), die am Tag 4 verändert wurden. Ebenso bestätigte diese Studie 29 der 81 DEGs nach einer Infektion durch RSV ( einschließlich CFAB, GBP2/4/5/6, IFIT1, IIGP1, K2C6A, MX2, OASL2, RSAD2; vollständige Daten in der Zusatzdatei 5), die am Tag 6 geändert wurden.

Baumwollratten sind ausgezeichnete präklinische Tiermodelle für die Untersuchung von Infektionen mit RSV und anderen Viren, aber ohne ein veröffentlichtes Genom für eine der Arten ist die genetische oder transkriptomische Analyse bei Baumwollratten begrenzt. In dieser Studie haben wir umfassende Transkriptome aus mehreren Organen zweier Inzuchtarten von Baumwollratten generiert: S. fulviventer und S. hispidus. Der Vergleich unserer beiden transkriptomischen Referenzen ergab große Unterschiede in der Transkriptsequenzhomologie und den Basisgenexpressionsniveaus zwischen den einzelnen Arten, obwohl die Gesamtzahl der annotierten Gene und Funktionskategorien (Genontologie, KEGG-Begriffe) ähnlich waren (Tabelle 1).

Unsere Transkriptomassemblierung und -annotation übertrifft die Qualitäts- und Vollständigkeitsstandards zuvor veröffentlichter Transkriptomreferenzen bei anderen Tieren35,36,47. Die Qualität und Tiefe unserer Transkriptomassemblierung verbesserte sich aufgrund der Einbeziehung mehrerer Gewebe auch gegenüber unserem vorherigen Lungentranskriptom von S. hispidus-Lungengeweben. Dies führte zu einer fast dreimal so hohen Anzahl annotierter Transkripte (117.153 gegenüber 38.736) und zusätzlichen 6169 einzigartigen Genannotationen in S. hispidus. Darüber hinaus zeigt unsere Anwendung der Transkriptomreferenz zur Ableitung RSV-induzierter Veränderungen der Genexpression den Nutzen unserer Referenz bei der Untersuchung und Behandlung vieler Infektionen, einschließlich RSV, Influenza und anderer Atemwegsviren.

Unsere Analyse bestätigte viele Gene, die zuvor an der RSV-Infektion und -Immunität beteiligt waren. RSAD2 (oder Viperin) ist ein bei einer RSV-Infektion in S. hispidus deutlich hochreguliertes Gen, das die RSV-Filamentbildung und die Zell-Zell-Virusübertragung hemmt, ohne die Expression viraler Proteine ​​zu hemmen48. Viperin ist auch das am stärksten hochregulierte Gen im menschlichen Nasenepithel nach einer intranasalen Exposition gegenüber Rhinovirus49. Ein weiteres RSV-bezogenes Gen ist I27L2, das am häufigsten hochregulierte Gen in S. hispidus und S. fulviventer, das auch das am häufigsten differenziell exprimierte Gen bei Frühgeborenen mit schwerer RSV-Infektion ist50. Zu den weiteren hochregulierten Genen, von denen ebenfalls gezeigt wurde, dass sie an einer RSV-Infektion beteiligt sind, gehören die Chemokine CXCL1051, CXCL1152, LY6E53, MX254, OAS1A55, ISG1556, IRF957, NLRC558 und K2C6A59. Wir identifizierten auch Gene, die am Komplementsystem (CFAB, CO4A, C4BPA) und am Prostaglandinstoffwechsel (PGDH) beteiligt sind, die beide an der Wirtsreaktion auf RSV beteiligt sind60,61. Die Ergebnisse unserer Studie untermauern die Bedeutung dieser Gene für den wirtsvermittelten Schutz gegen RSV und den translationalen Wert der Baumwollratte in der Virusforschung.

CRY2 (herunterreguliert in S. fulviventer) wurde indirekt auch auf die Schwere der RSV-Erkrankung zurückgeführt. CRY2 ist ein Transkriptionsfaktor, der den zirkadianen Rhythmus durch Unterdrückung von BMAL1 moduliert, einem mutmaßlichen Regulator zellulärer Faktoren, die für die Virusreplikation essentiell sind62. Die Analyse der BMAL1-/--Primärzellen ergab, dass eine niedrige BMAL1-Expression die Anfälligkeit für Influenza63, Parainfluenzavirus 3 und RSV64 erhöht. BMAL1 zeigt auch saisonale Schwankungen beim Menschen mit den niedrigsten Werten in den Wintermonaten während der Hauptsaison der Atemwegsviren62. Während die Rolle dieses Gens bei der RSV-Pathogenese noch weiter untersucht werden muss, ist dies der erste Zusammenhang mit einer modulierten Expression während einer RSV-Infektion.

Die Baumwollratte ahmt Atemwegsinfektionen beim Menschen nach, da menschliche homologe Gene vorhanden sind, die bei anderen Labornagetieren (z. B. Mus musculus) fehlen, d. h. Interferon-stimulierte MX-Gene65. Unsere Analyse steht im Einklang mit der Hochregulierung von MX2 sowohl in S. fulviventer als auch in S. hispidus (sowie MX1, MX1B und MX3 in S. fulviventer) nach einer RSV-Infektion, wie zuvor beschrieben66, was die Bedeutung dieses Modells für die Erfassung von Interferonen unterstreicht. induzierte Immunantwort auf RSV und andere Viren. Darüber hinaus erfasst unsere Analyse die IIGP1-Hochregulation in S. fulviventer und S. hispidus. IIGP1 ist ein weiteres menschliches Interferon-stimuliertes Gen mit ähnlicher Bedeutung und Funktion wie Mx-Gene, es kommt jedoch nur in Mäusen als weniger wirksames Paralog IGPT67 vor. Eine Studie an IGPT-defizienten Mäusen ergab keine erhöhte Anfälligkeit oder Interferon-induzierte Zytokinproduktion gegenüber intrazellulären Krankheitserregern wie Listeria und Cytomegalievirus, was auf einen anderen vorgelagerten Mechanismus bei Mäusen schließen lässt68. Wir haben IIGP1 zum ersten Mal erfolgreich bei Baumwollratten annotiert und seine Modulation während einer RSV-Infektion gezeigt. Während funktionelle Validierungsstudien erforderlich sind, belegen die Ergebnisse unserer Studie weiterhin den translationalen Nutzen der Baumwollratte als Modell für RSV und andere Atemwegsviren im Vergleich zu Mäusen, denen IIGP-1 fehlt.

CREB1 (cAMP-responsives Element-Bindungsprotein 1) ist ein umfassend untersuchter Transkriptionsfaktor, der viele Immungene moduliert und in S. fulviventer nach einer RSV-Infektion herunterreguliert wurde. CREB1 fördert entzündungshemmende Reaktionen wie die Hemmung der NF-κB-Aktivität, die Induktion von IL-10 und die Bildung von Tregs69. Es wurde beobachtet, dass die CREB1-Aktivierung ein Treiber für die Wirksamkeit des Impfstoffs bei HIV-1-Impfstoffen bei nichtmenschlichen Primaten ist, indem sie CD4+-T-Zellen und B-Zellen an die Stelle der Antigenpräsentation rekrutiert70. Zukünftige Funktionsstudien sind erforderlich, um besser zu verstehen, ob ein Zusammenhang zwischen RSV und CREB1 besteht.

SYWC ist ein weiteres interessantes hochreguliertes Gen sowohl in S. fulviventer als auch in S. hispidus. Es ist ein Interferon-induzierter Aktivator der ERK-, Akt- und eNOS-Signalwege sowie der Reorganisation des Zytoskeletts als Reaktion auf Stress und ein Serummarker für Lungentuberkulose71. Während es sich bei dieser Studie um den ersten Zusammenhang zwischen SYWC und einer RSV-Infektion handelt, könnten weitere Untersuchungen ergeben, dass es sich um einen Marker für eine schwere RSV-Infektion in Gewebe und Serum handelt.

Obwohl wir einen umfassenden Überblick über das Transkriptom der Baumwollratte gegeben haben, erkennen wir in unserer Studie einige Einschränkungen. Zuvor veröffentlichte Daten von Pletneva et al. hat gezeigt, dass verschiedene RSV-Stämme und -Isolate bei Baumwollratten eine unterschiedliche Induktion von Interferon-aktivierten Genen aufweisen66. Während die Studie von Pletneva et al. umfasst nur S. hispidus. Wir gehen davon aus, dass dies aufgrund der ähnlichen Anfälligkeit für RSV A/Long auch für S. fulviventer gilt. Zu diesem Zweck erkennen wir an, dass unsere Schlussfolgerungen auf RSV A/Long beschränkt sind und dass ein transkriptomischer Vergleich von RSV-Varianten für zukünftige Studien in Betracht gezogen werden sollte. Darüber hinaus haben wir mehrere Gene identifiziert, die bisher nicht an einer RSV-Infektion beteiligt waren, wie z. B. (LG3BP, SYWC, ABEC1, IIGP1, CREB1). Während unsere Analyse auf potenziell unbekannte Mechanismen der Pathogenese schließen lässt, sind wir uns bewusst, dass die Assoziation dieser Gene mit einer RSV-Infektion mangels experimenteller Daten stark eingeschränkt ist. Derartige Bemühungen würden den Rahmen dieser Arbeit zum Referenztranskriptom der Baumwollratte sprengen, werden aber für zukünftige Studien in Betracht gezogen.

Dieser Bericht unterstreicht den Nutzen des Baumwollratten-Transkriptoms zum Verständnis infektionsbedingter transkriptomischer Veränderungen in Abwesenheit verfügbarer Genomreferenzen. Sowohl S. hispidus- als auch S. fulviventer-Transkriptomreferenzen wurden im BioProject PRJNA816878 für weitere Forschung öffentlich zugänglich gemacht. Darüber hinaus ermöglicht die Identifizierung von Gensequenzen ein besseres Verständnis der Genetik von Baumwollratten und die Entwicklung molekularer Werkzeuge wie qRT-PCR-Primer und -Sonden, die auf interessierende Gene, rekombinantes Protein, Antikörper und andere Tests abzielen. Die Analyse der differentiellen Genexpression ergab wirtsspeziesspezifische Unterschiede bei einer RSV-Infektion. Da die Entwicklung von RSV-Therapeutika gut entwickelte, robuste präklinische Modelle für RSV erfordert, hoffen wir, dass unsere Transkriptomreferenzen und Genassoziationen mit RSV biomedizinische Interventionen gegen diesen Erreger von erheblicher Bedeutung für die öffentliche Gesundheit beschleunigen können.

Vier bis sechs Wochen alte S. hispidus (n = 8 Männchen, 1 Weibchen) und S. fulviventer (n = 8 Männchen, 1 Weibchen) Baumwollratten (~ 100 g) wurden aus der bei Sigmovir Biosystems gehaltenen Inzuchtkolonie gewonnen , Inc. Baumwollratten in der Kolonie waren laut ELISA seronegativ gegenüber zufälligen Atemwegsviren (z. B. Lungenentzündungsvirus von Mäusen, Rattenparvovirus, Rattencoronavirus, Sendai-Virus). Jede Art wurde zufällig in zwei Gruppen aufgeteilt: RSV-infizierte (n = 5) und nicht infizierte Kontrollen (n = 4). Die Transkriptomassemblierung und -annotation wurde an allen Geweben (gesamte Lunge, Dickdarm, Herz, Milz und Niere) von zwei Männern in jeder nicht infizierten Gruppe durchgeführt. Weibliche Tiere wurden nur in RSV-infizierte Gruppen einbezogen. Um Kämpfe zu vermeiden, wurden alle Tiere einzeln in großen Polycarbonatkäfigen gehalten und mit normalem Nagetierfutter und Wasser nach Belieben gefüttert. Alle Tierversuche folgten den NIH- und USDA-Richtlinien, die von Sigmovir Biosystems, Inc. IACUC genehmigt wurden. Studiendesign, Analyse und Berichterstattung über Methoden und Ergebnisse werden gemäß den ARRIVE-Richtlinien präsentiert.

Der Long-Stamm von RSV A/Long (ATCC Cat. # VR-26) wurde in HEp-2-Zellen vermehrt und der Virustiter wurde mittels Plaque-Assay bestimmt. Baumwollratten wurden unter Isofluran-Anästhesie intranasal mit 105 Plaque-bildenden Einheiten in 100 µl RSV-Suspension oder PBS-Vehikel geimpft. Die Tiere wurden am 5. Tag der Infektion durch Kohlendioxid-Inhalation getötet. Die gesamte Lunge, der Dickdarm, das Herz, die Milz und die Niere wurden von allen Tieren präpariert und später in RNA (Invitrogen AM7021) zur Verarbeitung und Sequenzierung bei VUMC eingefroren.

Die Lungen (rechter Lappen) wurden präpariert und mit 10 % neutral gepuffertem Formalin aufgeblasen und zur Fixierung in Formalin getaucht. Die Lungen wurden in Paraffinblöcke eingebettet, geschnitten und mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt. Die Pathologen waren für die Studiengruppe blind und die Objektträger wurden auf vier Parameter der pulmonalen Immunzellinfiltration und -entzündung untersucht, wie zuvor beschrieben72: Peribronchiolitis (Bronchiolen), Perivaskulitis (kleine Blutgefäße), interstitielle Pneumonie (Alveolarwände) und Alveolitis (Alveolarraum). ) (aufgelistet vom geringsten zum größten Schweregrad). Jedem Zustand wurde eine Bewertung von 0 bis 4 zugewiesen, wobei 0 keine Pathologie und 4 maximale Pathologie bedeutet. Die Werte entsprechen dem Prozentsatz der Pathologie im in Abb. 4A dargestellten Sichtfeld (0 = 0 %, 1 = 5 %, 2 = 25 %, 3 = 75 % und 4 = 100 %). Die kumulativen Pathologie-Scores wurden durch Summieren der Median-Scores für jede Erkrankung berechnet.

Die Anzahl der viralen RNA-Kopien wurde mithilfe der Echtzeit-quantitativen Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) aus RNA bestimmt, die aus Lungenhomogenaten (Lingularlappen) extrahiert wurde (Extraktionsmethoden finden Sie im nächsten Abschnitt zur RNA-Extraktion und Vorbereitung der cDNA-Bibliothek). Nach der Extraktion wurde cDNA unter Verwendung von 1 μg Gesamt-RNA und dem SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen™)-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers generiert. Die cDNA wurde 1:5 verdünnt und 3 µL wurden den qPCR-Reaktionen unter Verwendung von iQ™ SYBR® Green Supermix zugesetzt (insgesamt 10 µL). Die Reaktionen für jedes Ziel wurden für jede Probe doppelt durchgeführt, wobei Primer (IDT, 250 nm Endkonzentration) verwendet wurden, die auf die G- und F-mRNA von RSV und β-Actin abzielten und die zuvor veröffentlicht und für die Verwendung bei beiden Arten von Baumwollratten validiert wurden73. Auf jeder Platte wurden Kontrollen ohne Vorlage und eine Positivkontrolle (RNA, extrahiert aus RSV A/Long-Virusstamm, der für die Infektion verwendet wurde) durchgeführt. Die CT-Werte für G und F wurden gemittelt und auf β-Actin normalisiert. Die Ergebnisse wurden mit der 2−ΔΔCT-Methode74 berechnet. Zahlen und statistische Analysen wurden mit dem Mehrfachvergleichstest von ANOVA/Tukey in Prism 8 durchgeführt.

Die RNA wurde wie zuvor beschrieben hergestellt27. Zusammenfassend wurden kleine Abschnitte der Lunge (Lingularlappen) der Baumwollratte, des Dickdarms (~ 20 mm Dickdarm, mit sterilem PBS gespült), der Milz, der Niere und des Herzens unter Verwendung eines NextAdvance Bullet Blender® mit RED RINO™-Röhrchen mit 3,2 mm homogenisiert Edelstahlperlen (SSB32) und 2 × Volumen QIAzol® Lysis Regent (Qiagen, Kat.-Nr. 79306) bei maximaler Geschwindigkeit für 3 Minuten. RNA wurde aus Homogenaten mit dem RNeasy® Plus Universal Mini Kit (Qiagen, Kat.-Nr. 73404) über zusätzliches QIAzol® (Gesamtvolumen 900 µL), gDNA-Eliminator und Chloroform mit Säulen-DNase-Verdau extrahiert, wie im Protokoll des Herstellers empfohlen. Die RNA-Qualität wurde mit einem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, CA, USA) gemessen. Die Wirts-rRNA wurde mit dem NEBNext rRNA Depletion Kit v2 (Kat.-Nr.: NEB E7400X) entfernt. Die cDNA-Bibliotheken wurden mit 1 μg Gesamt-RNA aus jeder Probe unter Verwendung des NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit für Illumina (Kat.-Nr.: NEB E7805L) gemäß dem Herstellerprotokoll für intakte RNA (RIN > 7) und AMPure XP Beads für Reinigungsschritte vorbereitet (Beckman, Kat.-Nr. A63881) und NEBNext Multiplex Oligos für Illumina (Set 1, Kat.-Nr.: E7600S) zum Poolen von Proben. Die Sequenzierung wurde mit Illumina NovaSeq6000 2 × 150 bp Sequenzierung in der Kernanlage von Vanderbilt Technologies for Applied Genomics (VANTAGE) durchgeführt.

Die Daten wurden dann per Barcode in einzelne Proben zerlegt. Adaptersequenzen, Lesevorgänge von geringer Qualität (mindestens Phred 33) und kurze Lesevorgänge (< 75 bp) wurden mit Trimmomatic (Version 0.36, „ILLUMINACLIP: NEB_multiplexoligos.fa:2:30:10 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:75“) entfernt ")75. Nur Paired-End-Lesevorgänge, die den in 76 beschriebenen Qualitätsschwellenwert überschritten, wurden beibehalten.

Etwa 921 Millionen Paired-End-Reads aus gesunden Geweben wurden für die De-novo-Transkriptomassemblierung mit dem Softwarepaket Trinity v2.13.131 mit Standardparametern von 50-facher Abdeckung verwendet. Für die experimentelle Analyse wurden zusätzlich 314,5 Millionen Paired-End-Messwerte aus virusinfizierten Lungen verwendet. Für S. fulviventer und S. hispidus wurden Contigs zusammengestellt, indem zunächst einzelne Contigs/Transkripte zu „Genen“ geclustert und anschließend De-Bruijn-Graphen erstellt wurden, um alternativ gespleißte Isoformen in voller Länge zu erfassen. Alle Transkripte wurden dann nach einem Transkriptlängen-Cutoff von < 200 bp unter Verwendung von SeqKit32, Kontaminantenannotation (Blast-Annotation von „Virus“, „Bakterien“ oder „Pilzen“), Sequenzähnlichkeit von 95 % oder mehr unter Verwendung von CD-HIT33 und Entfernung gefiltert von redundanten mRNAs, die von der EvidentialGene tr2aacds-Pipeline ausgewählt wurden34. Zusammenstellungsstatistiken der endgültigen Transkripte, wie z. B. mittlere Anzahl von Transkripten, Transkriptlänge, mittlere Transkriptlänge, N50, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Rohlese- und Zusammenstellungsdaten werden bei Annahme des Manuskripts zur Veröffentlichung im SRA unter BioProject PRJNA816878 hinterlegt.

Das RSEM-Paket wurde zur Quantifizierung und Normalisierung der Gen- und Isoformhäufigkeiten aus Paired-End-RNA-Seq-Daten77 verwendet. RSEM ermöglicht eine genaue Transkriptquantifizierung pro Probe und Probentyp ohne Referenzgenom. TPM (Transkript pro Million zugeordneter Lesevorgänge) wurde unter Verwendung des RSEM-Pakets mit Bowtie2-Aligner berechnet und ein TPM-Grenzwert von > 1 wurde verwendet, um die zusammengestellten Transkripte geringer Qualität zu filtern, die für die Analyse der differentiellen Expression verwendet werden sollen. Der Ex90N50 wurde mit dem Trinity-Skript contig_ExN50_statistic.pl berechnet.

Die Annotationspipeline Trinotate v3.2.2 wurde verwendet, um Transkripte von S. hispidus und S. fulviventer zu kommentieren. BlastX und BlastP (E-Wert-Cutoff von 1e-05)42 wurden verwendet, um die Sequenzhomologie einzelner Contigs und proteinkodierender Regionen (bestimmt durch Transdecoder, https://github.com/TransDecoder/TransDecoder) mit der UniProt/SwissProt-Datenbank zu ermitteln41 (Daten finden Sie in der Zusatzdatei 6). KEGG-Begriffe43, Gene-Ontologie-Begriffe44 und EggNOG-Begriffe45 aus der Swissprot41-Datenbank im Einklang mit BLAST42. Andere Tools in der Pipeline annotierten Transkripte basierend auf Proteindomänen über Pfam78, Transmembranhelices über TmHMM79 und Signalproteinen80.

Aus RSV-infizierten und nicht-infizierten Gruppen isolierte Lungen wurden wie oben beschrieben verarbeitet und sequenziert. Die Trinotate-Pipeline wurde verwendet, um alle Lesevorgänge aus experimentellen Gruppen anhand unserer Referenz zu kommentieren. Normalisierte Expressionsniveaus von Transkripten über Gewebe hinweg wurden mithilfe von Salmon81 und der TPM-Metrik (Transkripte pro Million) bestimmt; Für die nachgeschaltete differenzielle Expressionsanalyse wurden nur Transkripte mit einem TPM > 1 verwendet (S. fulviventer = 270.451, S. hispidus = 474.882). Rohe Zählmatrizen auf Genebene für jede Art finden Sie in der Zusatzdatei 7. Das DESeq2-Paket38 wurde in der Pipeline verwendet, um die Versuchsgruppe (RSV-infizierte Lungen), die biologische Replikate enthält, mit der entsprechenden Kontrollgruppe (nicht infizierte Lungen) zu vergleichen. Gene mit ap < 0,05, angepasstem p < 0,05 („q“/Falscherkennungsrate/Benjamini-Hochberg) und einer log2-fachen Änderung >|1| wurden als differenziell ausgedrückt behandelt. Wir haben das Goseq-Paket in Bioconductor verwendet, um unterschiedlich häufig vorkommende GO-Begriffe zu erkennen44. GOs mit ap < 0,05 und angepasstem p < 0,05 („q“/Falscherkennungsrate/Benjamini-Hochberg) wurden als differenziell ausgedrückt behandelt.

Aus dem Lungengewebe extrahierte RNA wurde für qRT-PCR-Assays verwendet. qRT-PCR wurde in zweifacher Ausfertigung mit dem SuperScript™ III Reverse Transcriptase (Invitrogen™) Kit und iQ™ SYBR® Green Supermix wie oben beschrieben durchgeführt. qRT-PCR-Primer wurden für drei zufällig ausgewählte hochregulierte Gene basierend auf De-novo-Assemblierung und differentieller Expressionsanalyse entwickelt (Shisp_DN132151_c0_g1, Shisp_DN12103_c7_g1, Sfulv_DN158_c1_g1). Primer wurden mit Primer3Plus82 entworfen und sind in der Ergänzungstabelle 2 aufgeführt. Auf jeder Platte wurden Kontrollen ohne Vorlage durchgeführt. Die technischen Replikat-CT-Werte wurden für jedes Gen gemittelt und auf das β-Actin-Housekeeping-Gen normalisiert. Die Ergebnisse wurden als fache Änderungsinduktion gegenüber nicht infizierten Lungen unter Verwendung der 2−ΔΔCT-Methode74 berechnet. Um die unterschiedliche Expression von Genen weiter zu bestätigen, verglichen wir außerdem die Ergebnisse unserer aktuellen Studie mit unserer vorherigen Annotation des S. hispidus-Lungentranskriptoms bei RSV-Infektion27 unter Verwendung derselben DESeq2-Signifikanzparameter (p < 0,05, q < 0,05, l2fc >|). 1,0|).

An dieser Studie nahmen keine menschlichen Probanden teil. Alle Tierversuche folgten den NIH- und USDA-Richtlinien und wurden vom IACUC von Sigmovir Biosystems, Inc. genehmigt.

Die Sequenzierungsdaten werden nach Annahme des Manuskripts unter BioProject PRJNA816878 im NCBI Short Read Archive (SRA) hinterlegt. Für weitere Einzelheiten wenden Sie sich bitte an die entsprechenden Autoren für spezifische Datenanfragen.

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Wir danken Herrn Charles Smith und Frau Martha Malache, ABSL2-Techniker bei Sigmovir Biosystems Inc., für die Zucht, Handhabung und Pflege von Baumwollratten. Wir danken Angela Jones und anderen bei VANTAGE für die Qualitätskontrolle und Sequenzierung unserer Proben.

Diese Arbeit wurde durch Mittel des National Institute of Allergy and Infectious Diseases (unter den Fördernummern R21AI142321-02S1, R21AI142321, R21AI154016 und R21AI149262) unterstützt; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse AI163543, AI109926, AI125215 an JCGB unterstützt; die Centers for Disease Control and Prevention (CDC) 75D3012110094; das National Heart, Lung, and Blood Institute (unter den Auszeichnungsnummern K23HL148638 und R01HL146401) und das Vanderbilt Technologies for Advanced Genomics Core (Unterstützung durch die National Institutes of Health unter den Auszeichnungsnummern UL1RR024975, P30CA68485, P30EY08126 und G20RR030956). Für die Inhalte sind ausschließlich die Autoren verantwortlich und geben nicht unbedingt die offizielle Meinung der Fördergeber wieder.

Abteilung für Pathologie, Mikrobiologie und Immunologie, Vanderbilt University Medical Center, Nashville, TN, USA

Britton A. Strickland & Suman R. Das

Abteilung für Infektionskrankheiten, Abteilung für Medizin, Vanderbilt University Medical Center, 1211 21st Avenue South, S2108 Medical Center North, Nashville, TN, 37232, USA

Seesandra V. Rajagopala, Meghan H. Shilts, Suman B. Pakala und Suman R. Das

Sigmovir Biosystems Inc., 9610 Medical Center Drive, Suite 100, Rockville, MD, 20850, USA

Arash Kamali, Marina S. Boukhvalova und Jorge CG Blanco

Abteilung für Informatik, Genomik und Bioinformatik-Cluster, University of Central Florida, Orlando, FL, USA

Shibu Joseph

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BAS, SVR, SY, JCGB und SRD trugen zum Studiendesign bei. AK und MSB beteiligten sich an den Tierversuchen und der Probensammlung. BAS trug zur Probenverarbeitung und -sequenzierung bei. BAS trug mit Beratung von SVR, MHS, SBP und SYJCGB zu bioinformatischen und statistischen Analysen bei und SRD erhielt die Forschungsfinanzierung zur Unterstützung dieser Studie. BAS und SRD haben die erste Version des Manuskripts verfasst und alle Autoren haben die endgültige Version überprüft und genehmigt. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft und der Veröffentlichung zugestimmt.

Korrespondenz mit George CG White oder Suman R. Das.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Strickland, BA, Rajagopala, SV, Kamali, A. et al. Speziesspezifische transkriptomische Veränderungen bei einer Infektion mit dem Respiratory Syncytial Virus bei Baumwollratten. Sci Rep 12, 16579 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-19810-4

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Eingegangen: 27. Mai 2022

Angenommen: 05. September 2022

Veröffentlicht: 04. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-19810-4

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