ACSS2

Scientific Reports Band 13, Artikelnummer: 1483 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Alkaliptose ist eine kürzlich entdeckte Form des pH-abhängigen Zelltods, der zur Tumortherapie eingesetzt wird. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen und regulatorischen Netzwerke sind jedoch weitgehend unbekannt. Hier berichten wir, dass das Acetat-aktivierende Enzym Acetyl-CoA-Kurzkettensynthase-Familienmitglied 2 (ACSS2) ein positiver Regulator der Alkaliptose in menschlichen Zellen des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas (PDAC) ist. Mithilfe von qPCR und Western-Blot-Analyse fanden wir heraus, dass die mRNA- und Proteinexpression von ACSS2 in menschlichen PDAC-Zelllinien (PANC1 und MiaPaCa2) als Reaktion auf den klassischen Alkaliptose-Aktivator JTC801 hochreguliert war. Folglich hemmte der Abbau von ACSS2 durch shRNAs den JTC801-induzierten Zelltod in PDAC-Zellen und ging mit einer Zunahme der Zellklonbildung und einer Abnahme des intrazellulären pH-Werts einher. Mechanisch trug die ACSS2-vermittelte Acetyl-Coenzym-A-Produktion und die anschließende Histonacetylierung zur NF-κB-abhängigen CA9-Herunterregulierung bei, und dieser Effekt wurde durch den Histon-Deacetylase-Inhibitor Trichostatin A verstärkt. Diese Ergebnisse könnten neue Erkenntnisse zum Verständnis der metabolischen Grundlagen der Alkaliptose liefern und eine mögliche Strategie für die PDAC-Behandlung festlegen.

Es gibt viele verschiedene Arten des regulierten Zelltods (RCD), die signifikante morphologische, biochemische und genetische Merkmale aufweisen1. Apoptose ist die am besten untersuchte Form der RCD. Es beinhaltet die Bildung membrangebundener apoptotischer Körper und wird normalerweise durch die Caspase-Familie vermittelt. Allerdings bleibt die Apoptoseresistenz eine große klinische Herausforderung für die Krebsbehandlung2. Kürzlich wurde berichtet, dass mehrere Formen des nicht-apoptotischen Zelltods die apoptotische Toleranz zur Behandlung verschiedener Krebsarten überwinden können3. Unter diesen ist Alkaliptose ein pH-abhängiger RCD, der erstmals durch Arzneimittelscreening identifiziert wurde und menschliche Zellen des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas (PDAC) abtötet4. Die niedermolekulare Verbindung JTC801 ist derzeit ein typischer Alkaliptose-Auslöser, der auf der Aktivierung des Kernfaktors Kappa B (NF-κB) beruht und stattdessen seine bekannte Funktion als selektiver Antagonist von Schmerzpeptidrezeptoren erfüllt4. Die JTC801-vermittelte NF-κB-Aktivierung hemmt die Expression von Carboanhydrase 9 (CA9), deren Produkt den pH-Gleichgewicht reguliert und letztendlich zu Alkaliptose mit Plasmamembranbruch führt4. Ein besseres Verständnis des Mechanismus und der Regulierung der pH-Homöostase kann die Antikrebsaktivität einer auf Alkaliptose basierenden Therapie verbessern5.

Acetyl-Coenzym A (AcCoA) ist ein Metabolit, der eine zentrale Rolle bei der Energieproduktion, dem Lipidstoffwechsel und der Epigenommodifikation spielt6. Die AcCoA-Homöostase beeinflusst direkt den Grad der Histonacetylierung und reguliert dadurch die Genexpression7. AcCoA wird normalerweise auf zwei Wegen hergestellt6. Eine davon wird durch ATP-Citrat-Lyase (ACLY) vermittelt, die Zitronensäure in Oxalacetat und Acetyl-CoA spaltet. Die andere wird durch die Familie der Acetyl-CoA-Synthase-Kurzketten (ACSS) vermittelt, die Acetat und CoA verbindet. Die ACSS-Familie umfasst ACSS1, ACSS2 und ACSS3, die unterschiedliche subzelluläre Standorte und Funktionen haben. ACSS1 und ACSS3 befinden sich hauptsächlich in den Mitochondrien und sind an der oxidativen Phosphorylierung der Mitochondrien beteiligt, während ACSS2 hauptsächlich im Zellkern und im Zytoplasma lokalisiert ist8. Nuclear ACSS2 fängt das durch die Histon-Deacetylierung freigesetzte Acetat zurück, um es durch die Histon-Acetyltransferase9 zu recyceln. ACSS2 verwendet Acetat, um AcCoA für die De-novo-Lipogenese und Histonacetylierung bereitzustellen10. Obwohl ACSS eine Rolle bei der Regulierung des Überlebens und der Apoptose verschiedener Krebszellen spielt11,12, ist seine Rolle bei der Alkaliptose noch ungewiss.

In dieser Studie identifizieren wir eine neue Rolle von ACSS2 bei der Vermittlung von Alkaliptose in menschlichen PDAC-Zellen, indem wir die NF-κB-Aktivierung aufrechterhalten und anschließend den intrazellulären pH-Wert durch Histonacetylierung hochregulieren. Diese Erkenntnisse bestärken die Idee, dass krebserregende oder überlebensfördernde Signale genutzt werden können, um den Zelltod auszulösen.

Die Antikörper gegen ACSS2 (3658), GAPDH (5174), p-IKKα/β (2697), IKKα (11930), p-NF-κB (3033), IKBα (7217), acetyliertes Lysin (9814), IKKβ ( 8943), NF-κB (16502), p-IKBα (2859) und CA9 (5648) wurden von Cell Signaling Technology erhalten. Der Antikörper gegen PARP (13371-1-1-ap) wurde von Proteintech bezogen. JTC801 (S272201) wurde von Selleck Chemicals gekauft. Staurosporin (62996-74-1) und Trichostatin A (58880-19-6) wurden von MedChemExpress bezogen.

Die Zelllinien PANC1 (CRL-1469), MiaPaCa2 (CRL-1420) und CFPAC-1 (CRL-1918) wurden von der American Type Culture Collection bezogen. Die Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium mit 10 % fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und 100 U/ml Penicillin und Streptomycin gezüchtet. Die Zellkultur wurde in einen Inkubator bei 37 °C mit 5 % Kohlendioxid gegeben. Die Zelllinien wurden durch Short-Tandem-Repeat-Profiling validiert und routinemäßige Mykoplasmentests ergaben keine Kontaminationsergebnisse. Dimethylsulfoxid (DMSO) wurde zur Herstellung der Stammlösung der Arzneimittel verwendet. Die Endkonzentration von DMSO in der Arzneimittelarbeitslösung in den Zellen betrug < 0,01 %. Als Vehikelkontrolle wurde in allen Zellkulturtests 0,01 % DMSO verwendet13.

Die Array-Hybridisierung wurde gemäß dem Agilent Single-Color-Microarray-basierten Genexpressionsanalyseprotokoll (Agilent Technology)14 durchgeführt. Quantität und Qualität der RNA wurden mit NanoDrop ND-1000 gemessen. Die RNA-Integrität wurde durch standardmäßige denaturierende Agarosegelelektrophorese beurteilt. Die mRNA wurde nach der rRNA-Entfernung unter Verwendung des mRNA-ONLY eukaryotischen mRNA-Isolierungskits (Epicentre) von der Gesamt-RNA gereinigt. Die aus jeder Probe isolierte Gesamt-RNA (100 ng) wurde in cDNA umgewandelt, fragmentiert und mit GeneChip-Arrays hybridisiert. Hybridisierungsarrays wurden gewaschen, fixiert und mit dem Agilent DNA Microarray Scanner (P/N G2505C) gescannt. Der GeneChip 3000 Scanner (Affymetrix) wurde zum Scannen und Quantifizieren von Bildern hybridisierter GeneChip-Arrays verwendet. Der Intensitätswert für jede Sondenzelle im Array wurde von der GeneChip-Software berechnet.

Die vorgefertigte humane ACSS2-shRNA-1 (GCTTCTGTTCTGGGTCTGAAT), ACSS2-shRNA-2 (CGGTTCTGCTACTTTCCCATT) und leere Kontroll-shRNA (pLKO.1) wurden von Sigma-Aldrich in einem lentiviralen Format erworben. Wir haben 1 × 105 Zellen in jede Vertiefung einer Platte mit 12 Vertiefungen in 500 μl Vollmedium ausgesät und sie mit lentiviralen Vektoren bei einer MOI von 10:1 transduziert. Die Transduktion wurde in Gegenwart von Polybren (8 μg/ml) durchgeführt. Nach der Erholung mit vollständigem Kulturmedium wurde Puromycin (5 µg/ml) zur Selektion der transduzierten Zellen verwendet13.

Die Zellen wurden bei 4 °C in eiskaltem RIPA-Puffer (9806, Cell Signaling Technology) lysiert und Zelllysate wurden durch kurze Zentrifugation (13.000 × g, 15 Min., 4 °C) geklärt. Der Überstand wurde zur Immunpräzipitation mit den angegebenen Antikörpern verwendet. Im Allgemeinen wurden 2 mg Antikörper zum Überstand gegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Dann wurden 30 μl Protein G- oder A-Sepharose-Aufschlämmung zugegeben und die Probe weitere 2 Stunden bei 4 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Perlen ausgiebig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und die Proteine ​​durch Kochen in 2 × Natriumdodecylsulfat-Probenpuffer vor der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese4 eluiert.

Die Zellen wurden 1 × in Zelllysepuffer (Cell Signaling Technology, 9803) mit Protease- und Phosphatase-Inhibitor-Cocktail (Cell Signaling Technology, 5872) auf Eis 30 Minuten lang lysiert13. Nach 15-minütiger Zentrifugation bei 14.000 × g und 4 °C wurden die Überstände gesammelt und mithilfe eines Bicinchoninsäure-Assays (BCA) (Thermo Fisher Scientific, 23225) quantifiziert. Die 30 µg Proteine ​​wurden auf 10 % Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE)-Gelen (Epizyme, PG112) aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membranen (Millipore, IPVH00010) übertragen. Nach der einstündigen Blockierung durch TBST mit 5 % Magermilch wurden die Membranen über Nacht bei 4 °C mit verschiedenen Primärantikörpern (1:200–1:1000) inkubiert. Nach einstündiger Inkubation mit Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörpern (Kaninchen-Anti-Ziegen-IgG-Sekundärantikörper [Abcam, ab6741; 1:1000]) bei Raumtemperatur wurden die Signale mit SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenzsubstrat (Thermo Fisher Scientific, 34580) sichtbar gemacht ). Die Blots wurden mit dem ChemiDoc Touch Imaging System (Bio-Rad) und der Image Lab Software (Bio-Rad) analysiert. Alle Experimente wurden bei 5 % CO2 und Normoxie durchgeführt und mindestens dreimal wiederholt. Die repräsentativen Ergebnisse sind dargestellt.

Der Grad der Zelllebensfähigkeit wurde mit einem Cell Counting Kit-8 (CCK-8)-Kit (YEASEN, 40203ES80) gemäß dem Protokoll des Herstellers15 getestet. Die Zellen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen ausgesät (1 × 104 Zellen/Vertiefung) und 24 Stunden lang mit den angegebenen Verbindungen behandelt. Für jede Vertiefung der Platte wurde das Medium durch 100 µl frisches Medium mit 10 µl CCK-8-Lösungen ersetzt. Anschließend wurde die Kultur für 60–90 Minuten in den Zellinkubator zurückgebracht. Die Absorption bei 450 nm war proportional zur Anzahl lebender Zellen in der Kultur. Die Zelllebensfähigkeit wurde als relatives Niveau ausgedrückt und 100 % Zelllebensfähigkeit wurde auf 1 gesetzt.

Für den klonogenen Assay wurden Kontrollzellen oder mit JTC801 behandelte Zellen in Platten mit 12 Vertiefungen ausgesät (500 Zellen pro Vertiefung), dann wurde das Medium einmal alle 2 Tage gewechselt. Die Platten wurden 3 Wochen lang bei 37 °C inkubiert, bis Kolonien erschienen. Anschließend wurden die Zellen mit Methanol fixiert und die Kolonien mit 0,4 % Kristallviolett gefärbt.

Die Zellen wurden mit einer Dichte von 2 × 105 Zellen/Well in Medium in 6-Well-Platten ausgesät. Am nächsten Tag wurden die Zellen mit den angegebenen Behandlungen inkubiert. Danach wurden die Zellen 20–30 Minuten lang in einem Inkubator mit 5 % CO2 bei 37 °C mit Propidiumiodid (BestBio, BB-4131-1) gefärbt. Morphologische Veränderungen wurden mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 20-facher Vergrößerung untersucht. Ein automatischer Zellzähler Countess II FL (Thermo Fisher Scientific) wurde verwendet, um den Prozentsatz toter Zellen nach der Propidiumiodid-Färbung zu bestimmen. Der Zelltod wurde als relatives Niveau ausgedrückt und 100 % Zelltod wurde auf 115 festgelegt.

Die Gesamt-RNA wurde mit einem RNeasy Plus Micro Kit (QIAGEN, 74034) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert15. Zelllysate wurden mit den gDNA-Eliminator-Spinsäulen des Kits zentrifugiert, um genomische DNA zu entfernen. Die Gesamt-RNA wurde mit RNeasy MinElute Spin-Säulen gereinigt. Anschließend wurde die Erststrang-cDNA aus 1 µg RNA unter Verwendung von PrimeScript RT Master Mix (Takara, RR036A) synthetisiert. Dann wurden 20-µl-Reaktionen durch Kombinieren von 4 µl PrimeScript RT Master-Reaktionsmix, 2 µl genspezifischer Enhancer-Lösung, 1 µl Reverser Transkriptase, 1 µl genspezifischem Assay-Pool (20 ×, 2 µM) und 12 µl vorbereitet µl RNA verdünnt in RNase-, DNase- und genomischem DNA-freiem Wasser. Wir führten qPCR mit TB Green Premix Ex Taq II (Takara, RR820Q) auf dem C1000 Touch Thermocycler CFX96 Real-Time System (Bio-Rad) durch. Die Analyse wurde mit der Bio-Rad CFX Manager-Software 2.0 durchgeführt. Die Daten wurden auf RNA-GAPDH normalisiert und die Faltungsänderung mit der 2-DDCt-Methode berechnet. Die relativen mRNA-Konzentrationen wurden in willkürlichen Einheiten basierend auf der unbehandelten Gruppe ausgedrückt, der ein Wert von 1 zugewiesen wurde.

Um die Apoptoserate in WT- und ACSS2-Konckdown-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit Staurosporin (500 nM) oder JTC801 (3 µM) zu bestimmen, wurden die Zellen gesammelt und gemäß den Angaben des Herstellers mit dem Active Caspase-3/7 Staining Kit (Abcam, ab284532) verwendet Anweisungen. Der Fluoreszenzpeak von Caspase-3/7 wird mittels Durchflusszytometrie (BD FACSVerse, Becton, Dickinson and Company) unter Verwendung des FL-1-Kanals analysiert.

Für die PI-Färbung der Zellproben wurden die Zellen gesammelt und in Bindungspuffer (BD Biosciences, Nr. 556570) resuspendiert und anschließend mit Propidiumiodid (2 mg/ml) gefärbt. Die Daten wurden in BD FACSVerse gesammelt und analysiert.

Der extrazelluläre pH-Wert wurde mit einem pH-Meter (Seven Compact S210 pH/OPR-Meter, METTLER TOLEDO Instrument, USA) gemäß den Richtlinien des Herstellers gemessen. Der intrazelluläre pH-Wert wurde unter Verwendung einer fluorogenen zytoplasmatischen pH-Indikatorsonde (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die Fluoreszenzintensität der Sonde ist dann ein Indikator für den intrazellulären pH-Wert. Bei neutralem pH-Wert ist es schwach fluoreszierend, bei sinkendem pH-Wert jedoch zunehmend fluoreszierend. Dieses Reagenz kann den zellulären zytosolischen pH-Wert im Bereich von 9–4 mit einem pKa von ~ 6,5 bei Anregung/Emission von 509/533 nm quantifizieren. Die anschließende Verwendung des intrazellulären pH-Kalibrierungspuffer-Kits (P35379) ermöglicht die Quantifizierung dieses intrazellulären pH-Werts. Kurz gesagt, die Zellen wurden mit Live Cell Imaging Solution (LCIS) gewaschen, dann wurden 10 μl pHrodo™ Red AM oder pHrodo™ Green AM mit 100 μl PowerLoad™-Konzentrat gemischt und zu 10 ml LCIS gegeben. Die Zellen wurden mit pHrodo™ AM/PowerLoad™/LCIS 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und dann mit dem Cytation™ 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek, USA) unter Verwendung des 509/533 maxima4 analysiert.

Das zelluläre Acetyl-CoA wurde mit dem Acetyl-CoA Assay Kit (Sigma, MAK039) gemäß dem Protokoll des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, den Zellen wurde Perchlorsäure zugesetzt und homogenisiert. Nach der Zentrifugation (10.000 × g, 10 Min., 4 °C) wurden 400 μl Überstand mit 40 μl gesättigtem KHCO3 neutralisiert und 5 Min. bei 4 °C und 10.000 × g zentrifugiert. Eine Acetyl-CoA-Standardkurve wurde unter Verwendung verschiedener Konzentrationen (0–1000 pmol/ml) des bereitgestellten Acetyl-CoA-Standards erstellt. Die Hintergrundwerte wurden aus dem Standard eliminiert und die Konzentration der Proben wurde mit dem Cytation™ 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader (BioTek, USA) unter Verwendung der 535/587-Maxima berechnet.

Sofern nicht anders angegeben, werden die Daten als Mittelwert ± SD dargestellt. GraphPad Prism (Version 8.4.3) wurde zum Sammeln und Analysieren von Daten verwendet. Zum Vergleich der Mittelwerte zweier Gruppen wurden ungepaarte Student-t-Tests verwendet. Für den Vergleich zwischen den verschiedenen Gruppen bei allen paarweisen Kombinationen wurde eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) (für eine unabhängige Variable) mit Tukeys Mehrfachvergleichstest verwendet. In den Abbildungen wurden die folgenden Notationen verwendet: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001; ns: nicht signifikant.

Krebszellen benötigen eine Vielzahl metabolischer Umprogrammierungsvorgänge, um ihr Überleben und ihre schnelle Proliferation zu unterstützen. Diese überlebensfördernden Wege bieten Möglichkeiten für die Entwicklung neuer Strategien für gezielte Therapien. Um die metabolische Grundlage der Alkaliptose zu bestimmen, konzentrierten wir uns auf die Glykolyse und den Ein-Kohlenstoff-Metabolismus, die gemeinsame regulatorische Faktoren für das Wachstum von Tumorzellen16. Nach der Analyse der DNA-Microarray-Ergebnisse menschlicher PDAC-Zellen (MiaPaCa2, PANC1 und CFPAC1), die mit JTC801, ACSS2 und Hexokinase-Domäne-enthaltend 1 (HKDC1) behandelt wurden, wurden in allen Zelllinien hochregulierte Gene der Glykolyse und des Ein-Kohlenstoff-Stoffwechsels festgestellt (Abb. 1A). ). Die anschließende qPCR-Analyse bestätigte, dass die ACSS2-mRNA nach der JTC801-Behandlung sowohl in MiaPaCa2- als auch in PANC1-Zellen hochreguliert war (Abb. 1B). Da ACSS2 hauptsächlich am Lipidstoffwechsel beteiligt ist, verwendeten wir qPCR auch, um wichtige Gene des Lipidstoffwechsels zu untersuchen. Andere Gene, die mit dem Lipidstoffwechsel zusammenhängen, wie die von ACSS1, Fettsäuresynthase (FASN), MYC, Pyruvatdehydrogenasekinase 1 (PDK1) und Hexokinase 2 (HK2) sowie Anterior Gradient 2, Mitglied der Proteindisulfidisomerase-Familie (AGR2). ) wurden auch in PANC1- oder MiaPaCa2-Zellen in unterschiedlichem Maße hochreguliert (Abb. 1C). Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse, dass JTC801 dosis- und zeitabhängig die Hochregulierung des ACSS2-Proteins in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen induzierte (Abb. 1D, E). Im Gegensatz dazu wurde der Proteinspiegel von ACSS2 in PANC1-Zellen durch Staurosporin (einen Apoptose-Induktor) nicht hochreguliert (Abb. 1F). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ACSS2 während der Alkaliptose und nicht während der Apoptose hochreguliert wird.

ACSS2 wird während der Alkaliptose hochreguliert. (A) Wir analysierten die hochregulierten Gene, die am Glukosestoffwechsel und Kohlenstoffstoffwechsel in Bauchspeicheldrüsenkrebszellen beteiligt sind (MiaPaCa2, PANC1 und CFPAC-1), aus DNA-Microarray-Studien, nachdem die Zellen 24 Stunden lang mit JTC801 (3 μM) behandelt worden waren. (B) qPCR-Analyse der mRNA von ACSS2 und HKDC1 in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen, die 24 Stunden lang mit JTC801 (3 μM) behandelt wurden (n = 3 biologisch unabhängige Proben). (C) qPCR-Analyse der mRNA von ACSS1, ACSS2, FASN, MYC, AGR2, PDK1 und HK2 in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen, die 24 Stunden lang mit JTC801 (3 μM) behandelt wurden. (D) Western-Blot-Analyse der ACSS2-Proteinexpression in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit dem angegebenen JTC801. Die Membran wurde zugeschnitten und auf die angegebenen Antikörper untersucht. Quantitative Ergebnisse werden im rechten Bereich dargestellt. (n = 3 biologisch unabhängige Proben, ungepaarter t-Test). (E) Western-Blot-Analyse der ACSS2-Proteinexpression in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach Behandlung mit JTC801 (3 μM) für 6–24 Stunden (n = 3 biologisch unabhängige Proben, ungepaarter t-Test). Beta-Actin wurde als Ladungskontrolle untersucht. Quantitative Ergebnisse werden im rechten Bereich dargestellt. (F) Western-Blot-Analyse der angegebenen Proteinexpression in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit JTC801 (3 μM) oder Staurosporin (500 nM). Die PARP-Membran wurde abgezogen und erneut auf ACSS2 untersucht. Die Membran wurde 30 Minuten lang in Reblot-Lösung inkubiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit TBST-haltiger Hautmilch (5 %) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Anti-ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer, 46430) sondiert. Thermo Scientific). Quantitative Ergebnisse werden im rechten Bereich dargestellt.

Um festzustellen, ob das hochregulierte ACSS2 an der Alkaliptose beteiligt ist, haben wir zwei spezifische shRNAs verwendet, um ACSS2-Knockdown-PDAC-Zellen zu erzeugen. Western Blot bestätigte, dass in ACSS2-Knockdown-MiaPaCa2- und PANC1-Zellen der Proteinspiegel von ACSS2 um mehr als 70 % gehemmt war (Abb. 2A). Im Vergleich zur Kontrollgruppe war die Zellproliferation von ACSS2-Knockdown-MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 72 Stunden gehemmt (Abb. 2B), was die frühere Feststellung stützt, dass ACSS2 ein Proliferationsfaktor ist. Bezeichnenderweise hemmte der Abbau von ACSS2 die JTC801-induzierte Wachstumshemmung in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 24 Stunden (Abb. 2C), was eine andere Rolle von ACSS2 als Reaktion auf JTC801 beim Zelltod hervorhebt. In Übereinstimmung mit dem kurzfristigen Zelllebensfähigkeitstest zeigte der langfristige Zellklonierungstest, dass mit JTC801 behandelte ACSS2-Knockdown-Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe eine größere Proliferationsfähigkeit aufwiesen (Abb. 2D). Die Verwendung der Propidiumiodid (PI)-Färbung zur Messung des Plasmamembranbruchs bestätigte die Hypothese, dass ACSS2 ein positiver Regulator der Alkaliptose ist (Abb. 2E, Abb. S2). In Übereinstimmung mit früheren Studien11,12 waren ACSS2-Knockdown-Zellen resistent gegen Staurosporin-induzierte Apoptose, wie eine Western-Blot-Analyse der gespaltenen Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP1) und eine durchflusszytometrische Analyse der Caspase-3/7-Aktivität zeigten (Abb. 2F,G). Diese Daten belegen eine unterschiedliche Rolle von ACSS2 bei der Förderung der JTC801-induzierten Alkaliptose.

ACSS2 ist ein positiver Regulator der Alkaliptose. (A) Western-Blot-Analyse der ACSS2-Proteinexpression in angegebenen ACSS2-Knockdown-Zelllinien (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Die Membran wurde zugeschnitten und auf die angegebenen Antikörper untersucht. Quantitative Ergebnisse werden im rechten Bereich dargestellt. (B) Analyse der Zelllebensfähigkeit in den angegebenen Zellen nach 24–72 Stunden (n = 3 biologisch unabhängige Proben). (C) Analyse der Zelllebensfähigkeit in den angegebenen Zellen nach Behandlung mit JTC801 (1–5 µM) für 24 Stunden (n = 3 biologisch unabhängige Proben). (D) Analyse der Zellklonierungsbildung in den angegebenen Kontroll- oder JTC801-behandelten PANC1- und MiaPaCa2-Zellen. Quantitative Ergebnisse werden im unteren Bereich dargestellt. (E) Analyse des Zelltods durch PI-Färbung in den angegebenen Zellen nach Behandlung mit JTC801 (3 µM) für 24 Stunden (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Balken = 200 µm. Die quantitativen Ergebnisse sind im folgenden Feld dargestellt. (F) Western-Blot-Analyse der ACSS2- und C-PARP-Proteinexpression in den angegebenen Zellen nach Behandlung mit Staurosporin (500 nM) oder JTC801 (3 µM) für 24 Stunden (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Die Membran wurde zugeschnitten und auf die angegebenen Antikörper untersucht. Die PARP-Membran wurde abgezogen und erneut auf ACSS2 untersucht. Die Membran wurde 30 Minuten lang in Reblot-Lösung inkubiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit TBST-haltiger Hautmilch (5 %) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Anti-ACSS2 (Restore™ PLUS Western Blot Stripping Buffer, 46430) sondiert. Thermo Scientific). (G) Durchflusszytometrische Analyse der Caspase 3/7-Aktivität in den angegebenen Zellen nach Behandlung mit Staurosporin (500 nM) oder JTC801 (3 µM) für 24 Stunden (n = 3 biologisch unabhängige Proben).

Da ein erhöhter intrazellulärer pH-Wert ein wichtiges Stoffwechselereignis ist, das die Alkaliptose auslöst4, verwendeten wir eine pH-Fluoreszenzsonde zur Erkennung des intrazellulären pH-Werts. Wie erwartet erhöhte JTC801 den intrazellulären pH-Wert in MiaPaCa2- und PANC1-Zellen (Abb. 3A). Im Gegensatz dazu blockierte die Unterdrückung der ACSS2-Expression die durch JTC801 induzierte intrazelluläre pH-Hochregulierung signifikant (Abb. 3A). Als scharfe Kontrolle wurde der mit einem pH-Teststreifen gemessene extrazelluläre pH-Wert durch JTC801 in Kontroll- und ACSS2-Knockdown-MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nicht beeinflusst (Abb. 3B). Diese Ergebnisse legen nahe, dass ACSS2 die Alkaliptose durch die Hochregulierung des intrazellulären pH-Werts und nicht des extrazellulären pH-Werts fördert.

Die ACSS2-vermittelte Histonacetylierung hemmt die Ansäuerung des Zytoplasmas bei Alkaliptose. (A,B) Die intrazellulären und extrazellulären pH-Werte wurden in den angegebenen MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit JTC801 (3 μM) nachgewiesen (n = 3 biologisch unabhängige Proben). (C) ELISA-Analyse der Acetyl-CoA-Spiegel in den angegebenen MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit JTC801 (3 μM) (n = 3 biologisch unabhängige Proben). (D) Die intrazellulären pH-Werte wurden in den angegebenen MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit JTC801 (3 μM) und Trichostatin (TSA; 200 nM) nachgewiesen (n = 3 biologisch unabhängige Proben). (E) Die extrazellulären pH-Werte wurden in den angegebenen MiaPaCa2- und PANC1-Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit JTC801 (3 μM) und Trichostatin (TSA; 200 nM) nachgewiesen (n = 3 biologisch unabhängige Proben).

Um die Rolle von ACSS2 bei der Alkaliptose weiter zu definieren, haben wir den intrazellulären AcCoA-Spiegel untersucht. JTC801 induzierte die Hochregulierung von intrazellulärem AcCoA in Kontrollzellen, jedoch nicht in ACSS2-Knockdown-MiaPaCa2- und PANC1-Zellen (Abb. 3C). Trichostatin A (TSA), ein breiter Deacetylase-Inhibitor, der die Histonacetylierung17 verstärken kann, konnte in Wildtyp- und ACSS2-Knockdown-Zellen keine intrazelluläre oder extrazelluläre pH-Hochregulierung induzieren (Abb. 3D, E). Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ACSS2 die AcCoA-Produktion und die intrazelluläre pH-Hochregulierung während der JTC801-induzierten Alkaliptose vermittelt.

Eine der wichtigen Funktionen der ACSS2-vermittelten AcCoA-Produktion ist die Regulierung der Gentranskription durch Histonacetylierung10. Angesichts der Tatsache, dass die Aktivierung von NF-κB ein wichtiges Signalereignis ist, das die Alkaliptose antreibt, untersuchten wir als Nächstes die Beziehung zwischen der Histonacetylierung und dem NF-κB-Signalweg in Wildtyp- und ACSS2-Knockdown-Zellen als Reaktion auf JTC801.

Der IKK-Kinasekomplex besteht aus zwei Kinasen (IKKα und IKKβ) und einer regulatorischen Untereinheit, NEMO/IKKγ, die die Kernelemente der NF-κB-Kaskade sind18. IKK phosphoryliert das IκBα-Protein, was zur anschließenden IκBα-Ubiquitinierung führt, die schließlich vom Proteasom abgebaut wird18. Nachdem sich IκBα von NF-κB (RelA und p50) dissoziiert, wird aktiviertes NF-κB vom Zytoplasma in den Zellkern übertragen, wo es mit der Initiierung der Gentranskription beginnt18. Unsere Western-Blot-Ergebnisse zeigten, dass JTC801 die Proteinexpression von histonacetyliertem Lysin (AC-K2-100) (Abb. S3C und Abb. 3D) und die Kernkomponenten des NF-κB-Signalwegs (IKKα, IKKβ und NF-) hochreguliert. κB) in MiaPaCa2-Zellen (Abb. 4A, B) und der Zelllebensfähigkeitstest zeigten, dass Acetat die Empfindlichkeit von MiaPaCa2- und PANC1-Zellen gegenüber JTC801 erhöhte (Abb. S4). Im Gegensatz dazu kehrte der Abbau von ACSS2 diesen Prozess um und war mit einer Verringerung der NF-κB-Phosphorylierungsereignisse und einem Anstieg der CA9-Expression verbunden (Abb. 4A, B). Unsere CoIP-Experimente zeigen den Acetylierungsgrad von NF-κB in Zelllinien mit Abbau von ACSS2 (Abb. 4C). Wir haben auch den Acetylierungsgrad und die CA9-Expression nach ACSS2-Knockdown durch Western Blot nachgewiesen (Abb. S3A und S3B). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ACSS2 die NF-κB-vermittelte CA9-Herunterregulierung während der JTC801-induzierten Alkaliptose aufrechterhält. Als Positivkontrolle wurde CA9 während der CoCl2-induzierten Hypoxie hochreguliert (Abb. S5).

Die ACSS2-vermittelte Histonacetylierung fördert die Alkaliptose. (A,B) Western-Blot-Analyse der angegebenen Proteinexpression in Kontroll- oder ACSS2-Knockdown-Zelllinien nach 24-stündiger Behandlung mit JTC801 (3 μM) (n = 3 biologisch unabhängige Proben). Repräsentative Western-Blot-Ergebnisse werden im linken Bereich angezeigt. Die Membran wurde zugeschnitten und auf die angegebenen Antikörper untersucht. Die Membran von p-IKKα/β wurde abgezogen und erneut auf IKKα und IKKβ untersucht. Die Membran wurde 30 Minuten lang in Reblot-Lösung inkubiert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit TBST-haltiger Hautmilch (5 %) blockiert und über Nacht bei 4 °C mit Anti-IKKα sondiert. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte, um die Membran erneut mit dem Anti-IKKβ-Antikörper zu untersuchen. Die Membran von p-NFκB wurde abgezogen und erneut auf ACSS2 untersucht. Die Membran von p-IκBα wurde abgezogen und erneut auf IκBα und GAPDH untersucht. Die Proteinexpression von CA9 wurde in den angegebenen Zelllinien nach 24-stündiger Behandlung mit JTC801 (3 μM) unter 5 % CO2 und Normoxie gemessen. Quantitative Ergebnisse werden im rechten Bereich dargestellt. (C) Kontrolle oder ACSS2-Knockdown in MIAPaCa2- und PANC1-Zellen. Zelllysate wurden für CoIP extrahiert, die Immunpräzipitate wurden mit den angegebenen Antikörpern und dem im linken Feld gezeigten repräsentativen Western Blot analysiert. Die Membran von Ac-lys wurde abgezogen und erneut auf NFκB untersucht. (D) Kontroll- oder ACSS2-Knockdown-Zelllinien wurden 24 Stunden lang mit JTC801 (1–5 μM) in Abwesenheit oder Anwesenheit von Trichostatin (TSA, 200 nM) behandelt und anschließend wurde die Lebensfähigkeit der Zellen untersucht (n = 3 biologisch unabhängige Proben). . (E) Schematische Darstellung der Rolle von ACSS2 bei der JTC801-induzierten Alkaliptose.

Als nächstes untersuchten wir, ob TSA die hemmende Wirkung der Alkaliptose in ACSS2-Knockdown-MiaPaCa2-Zellen umkehren kann. Ein Zelllebensfähigkeitstest zeigte, dass TSA die Empfindlichkeit von ACSS2-Knockdown-MiaPaCa2-Zellen gegenüber JTC801 wiederherstellte (Abb. 4D). Im Gegensatz dazu war die Synergie von TSA und JTC801 in Wildtyp-Zellen schwach (Abb. 4D).

PDAC ist derzeit der tödlichste Krebs des Verdauungssystems mit einer 5-Jahres-Gesamtüberlebensrate von etwa 10 %. Im Vergleich zur aktuellen Chemotherapie, die Apoptose induziert, bieten nicht-apoptotische RCDs (einschließlich Alkaliptose) neue Möglichkeiten für die Behandlung von PDAC19. In dieser Studie haben wir gezeigt, dass ACSS2 ein neuer Regulator der Alkaliptose ist, indem es den NF-κB-Signalweg in menschlichen PDAC-Zellen aktiviert (Abb. 4E). Während ACSS2 Apoptoseresistenz vermitteln kann, wird es während JTC801-induzierter Alkaliptose in PDAC-Zellen hochreguliert. Diese Ergebnisse belegen, dass ACSS2 je nach Reiz eine doppelte Rolle beim Zelltod spielt. Die Induktion von Alkaliptose kann eine wertvolle Methode zur Behandlung von PDAC mit hoher ACSS2-Expression sein.

Im Vergleich zu gewebespezifischem ACSS1 und ACSS3 ist die Expression von ACSS2 in verschiedenen Geweben weit verbreitet20. Präklinische Studien haben gezeigt, dass ACSS2 Acetat zur Vermittlung der Histonacetylierung verwenden kann, die eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Genexpression, des Zellwachstums und der Krebsentstehung spielt9,10. In der aktuellen Studie haben wir gezeigt, dass die JTC801-induzierte Alkaliptose diesen ACSS2-abhängigen Histonacetylierungsweg erfordert. Obwohl globale genetische Veränderungen der JTC801-induzierten Alkaliptose in Zukunft noch untersucht werden müssen, haben wir festgestellt, dass die Expression und Aktivierung des NF-κB-Signalwegs in ACSS2-Knockdown-PDAC-Zellen beeinträchtigt ist. Wie ACSS2 ist NF-κB normalerweise ein überlebensfördernder Faktor, der die Apoptose hemmt. Allerdings beruht die Alkaliptose teilweise auf der Aktivierung von NF-κB, um die Expression von CA9 zu hemmen, was zu einem Anstieg des intrazellulären pH4 führt. Ein erhöhter intrazellulärer pH-Wert kann die gesamte Histonacetylierung, die von Monocarbonsäuretransportern abhängt, weiter beschleunigen21. Insgesamt stellen diese Ergebnisse eine mögliche Strategie für die Nutzung überlebensfördernder Signale oder Signalwege dar, um den Zelltod in PDAC-Zellen auszulösen.

Neben der Vermittlung der epigenetischen Regulation der Gentranskription durch Histonacetylierung besteht eine weitere wichtige Funktion der ACSS-Familie, einschließlich ACSS2, in der Tumorbiologie darin, die Fettsäuresynthese für das Tumorwachstum zu vermitteln6. Unter Fettsäuresynthese versteht man die Produktion von Fettsäuren aus AcCoA und NADPH durch FASN. Dennoch spielt eine übermäßige Fettsäuresynthese auch eine Rolle bei der Vermittlung des Zelltods, indem sie die von der Lipidperoxidation abhängige Ferroptose aktiviert. Insbesondere der Biosyntheseweg mehrfach ungesättigter Fettsäuren spielt eine wesentliche Rolle bei der Ferroptose22. Frühe Studien haben jedoch gezeigt, dass Ferroptosehemmer wie Ferrostatin-1 den JTC801-induzierten Zelltod nicht hemmen können4. Obwohl verschiedene RCDs möglicherweise einige Signale gemeinsam haben, sind ihre Effektoren und Rückkopplungsmechanismen unterschiedlich.

Bei der Alkaliptose handelt es sich im Allgemeinen um eine Form der regulierten Nekrose mit einem Bruch der Plasmamembran und der Freisetzung von schädigungsassoziierten molekularen Mustern (DAMPs). High-Mobility Group Box 1 (HMGB1) ist ein repräsentatives nukleares DAMP in einer Vielzahl von RCDs, das verschiedene Immunreaktionen auslösen kann. Beispielsweise kann HMGB1 von Krebszellen als Reaktion auf eine Chemotherapie oder Strahlentherapie freigesetzt werden, um umliegende Antigen-präsentierende Zellen zu aktivieren und so eine Antitumorimmunität zu erreichen23. Wir haben kürzlich beobachtet, dass HMGB1 ein Mediator der durch alkaliptotische Verletzungen verursachten Entzündungsreaktion ist24. Zusätzlich zur passiven Freisetzung erfordert die aktive Sekretion von HMGB1 in den extrazellulären Raum die Acetylierung von HMGB125. Es ist wichtig, weiter zu untersuchen, ob die Acetylierung und die Freisetzung von HMGB1 von der ACCS2-Hochregulierung bei Alkaliptose abhängig sind, was die Entwicklung von Immuntherapien für PDAC begünstigen könnte.

Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass ACCS2 ein neuer Regulator der Alkaliptose ist, indem es die Histonacetylierung aktiviert. Diese Ergebnisse unterstreichen die potenzielle Bedeutung von ACCS2 als Biomarker und Beitrag zur Alkaliptose-vermittelten Behandlung5.

Microarray-Daten werden in GEO unter der Zugangsnummer GSE206290 hinterlegt https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE206290 Geben Sie den Token ynipqmqkvrmlrux in das Feld ein.

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Wir danken Dave Primm (Abteilung für Chirurgie, University of Texas Southwestern Medical Center) für seine kritische Lektüre des Manuskripts.

Das DAMP-Labor, Drittes angegliedertes Krankenhaus der Medizinischen Universität Guangzhou, Guangzhou, 510120, Guangdong, China

Dongwen Que, Feimei Kuang und Jiao Liu

Abteilung für Chirurgie, UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, 75390, USA

Rui Kang & Daolin Tang

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DT und JL konzipierten und planten die Experimente. DQ, FK und JL führten die Simulationen und Probenvorbereitung durch und analysierten die Daten. DQ und DT haben den Artikel geschrieben. RK half bei der Dateninterpretation und redigierte das Manuskript. Alle Autoren gaben kritisches Feedback und halfen bei der Gestaltung der Recherche, Analyse und des Manuskripts.

Korrespondenz mit Daolin Tang oder Jiao Liu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Que, D., Kuang, F., Kang, R. et al. Die ACSS2-vermittelte NF-κB-Aktivierung fördert die Alkaliptose in menschlichen Bauchspeicheldrüsenkrebszellen. Sci Rep 13, 1483 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

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Eingegangen: 17. Mai 2022

Angenommen: 16. Januar 2023

Veröffentlicht: 27. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-28261-4

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